一種適用于室外的規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域、能源領(lǐng)域、環(huán)境領(lǐng)域，具體涉及一種適用于室外的 規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 化石能源儲(chǔ)存量日益縮減及其引起的環(huán)境問題和二氧化碳減排的需求增加，可再 生的生物質(zhì)能源成為世界能源結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整的一個(gè)重要方向。微藻因不與農(nóng)作物爭(zhēng)地、光 合效率高、油脂含量高、可多季節(jié)培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是當(dāng)今生產(chǎn)生物柴油最好的原料。但 室內(nèi)的優(yōu)良藻株如何走出實(shí)驗(yàn)室，在室外條件下如何進(jìn)一步篩選、進(jìn)一步放大培養(yǎng)規(guī)模、有 效的提高油脂生產(chǎn)率等都還無法做到。因此要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)鏈，還有很長(zhǎng)的路要走。
[0003] 同時(shí)在室外較大規(guī)模的培養(yǎng)條件下，采用價(jià)格低廉的培養(yǎng)原料是降低成本的重要 環(huán)節(jié)。在微藻的營(yíng)養(yǎng)元素中，其中氮源是一種不可缺少的大量成分，而在各種氮源中，以銨 鹽，硝酸鹽以及尿素較為常見。而在這些氮源當(dāng)中，尿素的價(jià)格相對(duì)低廉，因此是首選的氮 源營(yíng)養(yǎng)。為了進(jìn)一步提高微藻的油脂含量，目前主要采用方法是通過營(yíng)養(yǎng)鹽的缺失或者協(xié) 迫處理，如氮限制，磷限制，鹽協(xié)迫、等等。但在這種情況下，其生長(zhǎng)速度受到一定程度的限 制，最終藻細(xì)胞密度相比營(yíng)養(yǎng)充足條件下較低，結(jié)果就導(dǎo)致了低的油脂生產(chǎn)率。
[0004] 有人用兩階段方法對(duì) Nannochloropsis oculata 進(jìn)行了誘導(dǎo)[Su, C. H.，Chien, L. J. , Gomes, J. , Linj Y. S. , Yuj Y. K. , Liouj J. S. , Syuj R. J. 2011. Factors affecting lipid accumulation by Nannochloropsis oculata in a two-stage cultivation process.J Appl Phycol，23 (5)，903-908]，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定生物量以后，通過離心的方式收獲藻體然后把 這些藻培養(yǎng)于缺氮培養(yǎng)基誘導(dǎo)油脂積累。但是，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，通過離心收獲藻體并置 于無氮培養(yǎng)基條件這個(gè)過程，成本很高，如果在大規(guī)模培養(yǎng)情況下進(jìn)行這種操作是不可取 的。因此選用操作簡(jiǎn)便的兩階段誘導(dǎo)油脂積累很有必要，并且通過自養(yǎng)的兩階段誘導(dǎo)培養(yǎng) 產(chǎn)油微藻方面至今未有相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提出了一種適用于室外的規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠 藻的方法，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，其明顯縮短培養(yǎng)時(shí)間，節(jié)約培養(yǎng)成本，并且操作便利。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0007] -種適用于室外的規(guī)模化光自養(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法，包括：
[0008] 當(dāng)大型培養(yǎng)裝置中的產(chǎn)油藻達(dá)到0. 8-1. 5g/L時(shí)，添加 CH3COONa和NaCl，使其終濃 度分別為〇. 012-0. 12M和0. 017-0. 34M，同時(shí)保持光照，誘導(dǎo)1-3天，收集藻液。
[0009] 所述的光照，其光照強(qiáng)度彡400 μ mol m 2S \平均每天光照時(shí)間為8_13h ;
[0010] 所述的大型培養(yǎng)裝置為多140升的培養(yǎng)裝置；
[0011] 所述的大型培養(yǎng)裝置架設(shè)于室外溫室中；室外溫室包括但不限于由玻璃、陽光板、 透光薄膜等透光材料組成。
[0012] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，所述的產(chǎn)油藻為小球藻屬（包括普通小球藻 Chlorella Vulgaris、蛋白核小球藻chlorella pyrenoidsa等）、單針藻屬（包括戴伯單針 藻Monoraphidium dybowskii、極小單針藻Monoraphidium pusiIlum 等）、纖維藻屬（包括 鐮形纖維藻Ankistrodesmus falcatu等）、柵藻屬（包括斜生柵藻Scenedesmus obliquus、 四尾概藻 Scenedesmus quadricauda)、鏈帶藻屬（Desmodesmus intermedius) 〇
[0013] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，所述的大型培養(yǎng)裝置為140L柱狀光生物反應(yīng)器， 裝液量為120L，小球藻接種OD為0. 3。二氧化碳通氣量為6L/min，溫室內(nèi)溫度控制在 20-38°C，通過CO2控制藻液的pH在8. 70-9. 15,當(dāng)藻液濃度為I. 5g/L時(shí)，向柱狀反應(yīng)器中 加入終濃度為0. 17M的CH3COONa和終濃度為0. 12M的NaCl，光照，誘導(dǎo)2天。
[0014] 以上所述的方案中，優(yōu)選的，所述的大型培養(yǎng)裝置為5. 04m2的跑道池（規(guī)格為 4. 8 (長(zhǎng)）X 1. 05 (寬）X 0. 5 (深）），小球藻培養(yǎng)深度為20cm，跑道池的裝液量是1000L，攪拌 轉(zhuǎn)速為〇. 3m/s，攪拌時(shí)間段為8:00-17:00,同時(shí)在此時(shí)間段輔助以人工攪拌，即用地板刷 每隔4小時(shí)對(duì)跑道池中的藻液推動(dòng)一次，控制光強(qiáng)< 800 μ mol m 2S \其余時(shí)段靜置培養(yǎng)， 當(dāng)5. 04m2跑道池中的藻液OD達(dá)到0. 4時(shí)不需控制光強(qiáng)，培養(yǎng)到藻液濃度為1.0 g/L時(shí)向跑 道池中加入終濃度為0. 17M的CH3COONa和終濃度為0. 12M的NaCl，光照，誘導(dǎo)2天。
[0015] 以上所述方案中，優(yōu)選的，小球藻的培養(yǎng)基配方包括： 化學(xué)成分 ing/fL 尿素綱. K7HPO4 46 .MgSQ^OT2Q 75
[0016] Ni-n.COi 20 GiC.l，2H:0 3(， 檸檬酸 6 檸檬酸鐵銨 6: LDTA 1
[0017] 2.86x1 0- ΜηΠ:·4Η?0 1.8 i χ 10'； ZnSO,7H:;0 0.222 χ ΗΓ Ν??;ν?ο04·2Η；0 0.39\|0- CuS04*5H：(^ 0.079'<1ΓΓ； C"oC1：*6H；；0 0.050, 1 ??
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1).本發(fā)明提供了一種規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法，顯著提高油脂 產(chǎn)量，縮短培養(yǎng)周期，適用于工廠化的大型產(chǎn)油發(fā)酵。
[0020] (2).本發(fā)明中使用尿素代替NaNO3，可顯著降低培養(yǎng)成本。
[0021] (3).本發(fā)明中，用NaCl和CH3COONa結(jié)合光誘導(dǎo)，即能誘導(dǎo)油含量增加，同時(shí)生物 量也增加。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例所用的產(chǎn)油綠藻為小球藻Chlorella sp.來源于中國(guó)科學(xué)院淡水藻 種庫(kù)，編號(hào)FACHB-1748。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] -種適用于室外的規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法，包括以下步驟：
[0025] 1.原種制備
[0026] 1).對(duì)藻種進(jìn)行逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)，試管中的藻種擴(kuò)大到500mL。
[0027] 液體培養(yǎng)基400mL分裝到500mL三角瓶中，錫紙封口后滅菌，將小球藻Chlorella sp.(保藏于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，編號(hào)FACHB-1748)接種到500mL三角瓶中，接種量OD 為0. 05,通入空氣，剛開始時(shí)，通氣量為0. 3L/min，而且光強(qiáng)不超過400 μ mol m 2S \直到三 角瓶中顏色變綠且OD為0. 5后，加大通氣量，為0. 8L/min。光強(qiáng)也可緩慢增加，光強(qiáng)控制在 小于1000 μ mol m 2s 1D液體培養(yǎng)基見表1〇
[0028] 表 1

[0031] 2).將700mL和3. 5L液體培養(yǎng)基分別裝到IL和5L三角瓶中，用錫紙封口后滅 菌待用，接種步驟1中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻IOOmL到IL三角瓶中，再接IL三角瓶中對(duì)數(shù)期 的藻液200-300mL到5L三角瓶中（0D為0. 3左右），通氣管穿過棉塞，一端接0. 22 μm 濾膜的空氣過濾器，另一端通入藻液中，棉塞封口。通氣量為0. 8L/min，光強(qiáng)控制在小于 1000 μ molm 2s 1O
[0032] 實(shí)施例2 :
[0033] -種適用于室外的規(guī)?；庾责B(yǎng)雙階段培養(yǎng)產(chǎn)油綠藻的方法，包括以下步驟：
[0034] 本實(shí)施例所用培養(yǎng)基如表1所示，本實(shí)施例以架設(shè)于室外的陽光板溫室內(nèi)的柱狀 光生物反應(yīng)器為例進(jìn)行說明：
[0035] 1.將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻接種到140L柱狀光生物反應(yīng)器（140L反應(yīng)器由兩個(gè)70L 的柱狀光生物反應(yīng)器通過底部相聯(lián)通的通道組成，70L的反應(yīng)器的規(guī)格為：高I. 83m，直徑 為0. 22m，大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司）。柱狀光生物反應(yīng)器的裝液量為120L，接種OD為 0. 3。用型號(hào)為3L13XD的羅茨風(fēng)機(jī)加二氧化碳通過充氣管路對(duì)柱狀光生物反應(yīng)器進(jìn)行通氣 冒泡處理，通氣量為6L/min，陽光板溫室內(nèi)溫度控制在20-38 °C。通過CO2控制藻液的pH在 8. 70-9. 15,培養(yǎng)到藻液濃度為I. 5g/L。
[0036] 步驟1中小球藻擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，每天均為晴天，自然光強(qiáng)度為400-2