2-EV)、CSl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92細(xì)胞（NK-92-CS1-CAR)或磷酸鹽緩沖鹽水（陰性對(duì) 照）處理小鼠。圖19C是顯示來自圖19B的每只小鼠每秒的光子單位的定量總和的柱狀 圖。*表示P〈0. 05 ;林表示P〈0. 01。圖19D顯示相較于利用NK-92-EV細(xì)胞處理的小鼠，利 用NK-92-CS1-CAR細(xì)胞處理的荷頂9小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線。*表示P〈0. 05。
[0032] 圖20顯示CSlCAR的引入不導(dǎo)致NK細(xì)胞系的大量細(xì)胞凋亡。用7AAD和膜聯(lián)蛋白 V-V450對(duì)模擬物-或CS I-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK92或NKL細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。 NK-92-EV和NKL-EV分別表示空載體（EV)對(duì)照轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK-92和NKL細(xì)胞。NK-92-CS1-CAR 和NKL-CS1-CAR分別表示利用CSl-CAR構(gòu)建體進(jìn)行的NK-92和NKL細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0033] 詳述
[0034] 本文中公開了可特異性識(shí)別多發(fā)性骨髓瘤（MM)細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA)的 嵌合抗原受體（CAR)。還公開了經(jīng)工程化以表達(dá)這些CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞，諸如T細(xì)胞或自 然殺傷（NK)細(xì)胞。因此，還公開了用于在具有MM的受試者中提供抗腫瘤免疫的方法，該方 法包括過繼轉(zhuǎn)移經(jīng)工程化以表達(dá)公開的CSl-特異性CAR的公開的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0035] CSl-特異性嵌合抗原受體（CAR)
[0036] CAR通常包含來自具有參與淋巴細(xì)胞活化的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序的單克隆抗體 (mAb)的單鏈可變片段（scFv)的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域（Sadelain M，等Nat Rev Cancer 2003 3:35 - 45)。細(xì)胞表面糖蛋白CSl在骨髓瘤細(xì)胞的表面上高度且普遍地表達(dá)（Hsi ED，等 Clin Cancer Res 2008 14:2775 - 84)。CSl以極低的水平在大多數(shù)免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括自 然殺傷細(xì)胞（NK)細(xì)胞、某些亞組的T細(xì)胞和正常B細(xì)胞中表達(dá)，并且在骨髓細(xì)胞上幾乎是 不可檢測的（Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008 14:2775 - 84)。值得注意地，CSl在人造 血干細(xì)胞中極微弱地表達(dá)（Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008 14:2775 - 84)，所述造血干 細(xì)胞可用于干細(xì)胞移植來治療血液惡性腫瘤，包括MM。CSl在MM中的功能仍未完全理解， 并且據(jù)記載，CSl在骨髓瘤細(xì)胞附著、克隆形成生長和致腫瘤性中起作用（Benson DM Jr，等 J Clin Oncol 2012 30:2013 - 5 ;Tai YT，等Blood 2009 113:4309 - 18)。利用人源化mAb 依洛珠單抗（elotuzumab)革El向CSl在臨床上已被證明是安全的（Benson DM Jr，等J Clin Oncol 2012 30:2013 - 5 ;Tai YT，等 Blood 2009 113:4309 - 18)。臨床前研究顯示該抗 體抑制骨髓瘤細(xì)胞至骨髓基質(zhì)細(xì)胞的附著，誘導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒 性，并且在免疫缺陷型小鼠中消除由人骨髓瘤細(xì)胞起始的異種移植腫瘤（Benson DM Jr，等 J Clin Oncol 2012 30:2013 - 5 ;Tai YT，等 Blood 2009 113:4309 - 18 ;Tai YT，等 Blood 2008 112:1329 - 37)。因此，本文中公開了 CSl-特異性嵌合抗原受體（CAR)，其可在免疫效 應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)以增強(qiáng)針對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤的抗腫瘤活性。
[0037] 公開的CAR通常由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外 結(jié)構(gòu)域包含CSl-結(jié)合區(qū)并且負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。其通常還含有信號(hào)肽（SP)，以便CAR可被糖基 化和錨定在免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜中。跨膜結(jié)構(gòu)域（TD)正如其名稱所暗示的，連接胞外結(jié) 構(gòu)域與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并且當(dāng)由細(xì)胞表達(dá)時(shí)駐留在細(xì)胞膜內(nèi)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是在抗原識(shí)別后將活 化信號(hào)傳遞至免疫效應(yīng)細(xì)胞的CAR的作用端。例如，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可含有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域（ISD)和任選的共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)（CSR)。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，公開的CAR通過下式定義：
[0039] SP-CSl-HG-TM-CSR-ISD ;或
[0040] SP - CSl - HG - TM - ISD - CSR
[0041] 其中"SP"代表信號(hào)肽，
[0042] 其中" CS 1"代表CS 1結(jié)合區(qū)，
[0043] 其中"HG"代表任選的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，
[0044] 其中"TM"代表跨膜結(jié)構(gòu)域，
[0045] 其中"CSR"代表共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，
[0046] 其中"ISD"代表細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，以及
[0047] 其中""代表二價(jià)接頭。
[0048] 公開的CAR的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域通常是scFv。然而存在許多替代方案。來自天然T 細(xì)胞受體（TCR) α和β單鏈的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域已被描述為具有簡單的胞外結(jié)構(gòu)域（例如 識(shí)別HIV感染的細(xì)胞的CD4胞外結(jié)構(gòu)域）和更多外來識(shí)別組分諸如連接的細(xì)胞因子（其導(dǎo) 致具有細(xì)胞因子受體的細(xì)胞的識(shí)別）。事實(shí)上以高親和力結(jié)合給定靶標(biāo)的幾乎任何區(qū)域可 用作抗原識(shí)別區(qū)。
[0049] 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是在抗原識(shí)別（即，CS1)將信號(hào)傳遞至免疫效應(yīng)細(xì)胞后，激活至少一 種免疫效應(yīng)細(xì)胞的正常效應(yīng)子功能的CAR的作用端。T細(xì)胞的效應(yīng)子功能例如可具有細(xì) 胞溶解活性或輔助細(xì)胞活性，包括細(xì)胞因子的分泌。因此，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可包含T細(xì)胞受體 (TCR)和任選的共受體的"細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域"。雖然通?？墒褂猛暾募?xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在許多情況下，不必使用完整鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短的部分 而言，可將此類截短的部分用于替代完整鏈，只要其轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)。
[0050]調(diào)節(jié)以刺激性方式作用的TCR復(fù)合物的初級(jí)活化的胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列可含有稱 為基于免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。含有胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的 ITAM 的實(shí)例包括來源于 TCRG、FcRy、FcR0、CD3y、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和CD66d的那些。然而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于CD3 ζ (CD3 ζ )。 [0051 ] T細(xì)胞表面糖蛋白⑶3 ζ (⑶3 ζ )鏈，也稱為T細(xì)胞受體T3 ζ鏈或⑶247 (分化群 247)，是在人中由⑶247基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0052] 第一代CAR通常具有來自CD3 ζ鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其為來自內(nèi)源TCR的信號(hào)的 主要遞質(zhì)。第二代CAR將來自各種共刺激蛋白質(zhì)受體（例如，⑶28、41BB、IC0S)的細(xì)胞內(nèi) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域添加至CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以向T細(xì)胞提供另外的信號(hào)。臨床前研究已表明 第二代CAR設(shè)計(jì)提高T細(xì)胞的抗腫瘤活性。最近，第三代CAR組合多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來 進(jìn)一步增強(qiáng)效力。利用這些CAR移植的T細(xì)胞已顯示不依賴于共刺激受體/配體相互作用 的提高的擴(kuò)增、活化、保留和腫瘤消除功效（Imai C，等Leukemia 2004 18:676 - 84 ;Maher J，等 Nat Biotechnol 2002 20:70 - 5)。
[0053] 例如，CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)來通過自身或與任何其它所需的用于本發(fā)明的 CAR的上下文中的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組合來包含CD3 ζ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。例如，CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 可包含CD3G鏈部分和共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)是指包含共刺激分子的細(xì)胞 內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR的部分。共刺激分子是除抗原受體或它們的配體外的細(xì)胞表面分子，其是 淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的高效應(yīng)答所需的。此類分子的實(shí)例包括⑶27、⑶28、4-1ΒΒ (⑶137)、0X40、 CD30、CD40、IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和與 CD83特異性結(jié)合的配體等。因此，雖然CAR主要以CD28作為共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件來進(jìn)行舉 例說明，但也可單獨(dú)或與其它共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件組合來使用其它共刺激元件。
[0054] 在一些實(shí)施方案中，CAR包含鉸鏈序列。鉸鏈序列是促進(jìn)抗體柔性的氨基酸的短序 列（參見，例如，Woof等，Nat. Rev. Immunol.，4(2) :89-99(2004))。鉸鏈序列可被置于抗原 識(shí)別部分（例如，抗-CSl scFv)與跨膜結(jié)構(gòu)域之間。鉸鏈序列可以是從任何適當(dāng)?shù)姆肿友?生或獲得的任何適當(dāng)?shù)男蛄?。在一些?shí)施方案中，例如，鉸鏈序列衍生自CD8a分子或CD28 分子。
[0055] 跨膜結(jié)構(gòu)域可衍生自天然或合成來源。當(dāng)來源是天然時(shí)，結(jié)構(gòu)域可衍生自任何膜 結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜區(qū)可衍生自（即包含下述的至少跨膜區(qū)）T細(xì)胞受體的 α、β 或 ζ 鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、 CD86、CD134、CD137或CD154?；蛘撸缒そY(jié)構(gòu)域可以是合成的，在該情況下其將主要包含疏 水殘基諸如亮氨酸和纈氨酸。在一些情況下，苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體將見于合 成的跨膜結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)末端。短的寡肽或多肽接頭（諸如長度為2至10個(gè)氨基酸）可 在CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間形成鍵聯(lián)。
[0056] 二價(jià)接頭可以是適合于將化合物或核酸與多核苷酸序列連接的任何分子。用 于綴合生物分子諸如多核苷酸的方法和組合物描述于G. T. Hermanon, Biocon jugate Techniques (第2版），Academic Press (2008)(其通過引用整體（關(guān)于這些技術(shù)的教導(dǎo)） 并入）中。在一些情況下，二價(jià)接頭包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸。然而，其還可包含直接連接公 開的結(jié)構(gòu)域的肽鍵。
[0057] 在一些實(shí)施方案中，公開的CSl-特異性CAR包含如下的一個(gè)或多個(gè)：表1中所示 的3?、031、邪、了1、031?、130和/或接頭組分，或與表1中所示的序列具有至少65%、70%、 71 %、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一 性的其變體。
[0061] 因此，在一些實(shí)施方案中，公開的CSl-特異性CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1(下文中顯示的）或與 SEQ ID NO :28 具有至少 65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性的其變體。
[0062] CS1-CD28-CD3Z 構(gòu)建體：
[0063] MGffSSIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWI GMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYffGQGTSVTVSGGGG SGGGGSGGGGSDIVMTQSQKSMSTSV⑶RVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTG SGSGTDFTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELKLEPKSCDKTHTCPPCPDPKFWVLWVGGVLAC YSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST ATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID N0:28)。
[0064] 核酸和載體
[0065] 還公開了編碼公開的CSl-特異性CAR的多核苷酸和多核苷酸載體，所述多核苷酸 或多核苷酸載體允許CSl-特異性CAR在公開的免疫效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)。
[0066] 例如，在一些實(shí)施方案中，公開的CSl-特異性CAR由核苷酸序列SEQ ID NO :28(下 文中顯示的）或與 SEQ ID N0:29 具有至少 65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 序列同一性的其變體編碼。
[0067] PCDH-CSl-scFv-myc 標(biāo)簽-CD28-CD3 ζ (PCDH-CS1-CAR)構(gòu)建體：
[0068] ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTG CAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGGTACTCCTTCAC CACCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCGTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATA GTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG CAACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCTACTATGATTGCGACGAGGGCTAT GGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCG GTTCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCAGAAATCCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAG GCCAGTCAGGATGTTATTACTGGTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAATTACTGATTTACTC GGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCA GCAATGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCTCTCACTTTCGGTGCTGGG ACCAAGCTGGAGCTGAAACTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAATT TTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGG TGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAG CATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCA
[0069] GGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAA GAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCT CAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACA TGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID N0:29)。
[0070] 編碼公開的CAR及其區(qū)域的核酸序列可使用本領(lǐng)域中已知的重組方法來獲得，諸 如，例如使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過篩選來自表達(dá)所述基因的細(xì)胞的文庫，通過從已知包括所述基 因的載體衍生所述基因，或通過從含有所述基因的細(xì)胞和組織直接分離?；蛘撸赏ㄟ^合成 而非克隆來產(chǎn)生目標(biāo)基因。
[0071] 編碼CAR的核酸的表達(dá)通常通過可操作地將編碼CAR多肽的核酸與啟動(dòng)子連接， 并將所述構(gòu)建體整合進(jìn)表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)。典型的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序 列和用于調(diào)控所需核酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0072] 可將公開的核酸克隆進(jìn)許多類型的載體。例如，可將核酸克隆進(jìn)載體，包括但不限 于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特別受關(guān)注的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載 體、探針生成載體和測序載體。
[0073] 此外，可以以病毒載體的形式給細(xì)胞提供表達(dá)載體。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域 中是公知的并且描述于例如 Sambrook 等（2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)中，以及其它病毒學(xué)和分子生物學(xué)手 冊(cè)中。用作載體的病毒包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、皰疹病毒和 慢病毒。通常地，合適的載體含有在至少一個(gè)生物體中具有功能的復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子序 列、方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸載體是 慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0074] 許多基于病毒的系統(tǒng)已被開發(fā)用于將基因轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。例如，逆轉(zhuǎn)錄 病毒為基因遞送系統(tǒng)提供方便的平臺(tái)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)將所選定的基因插入載 體和包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。隨后可分離重組病毒，并將其體內(nèi)或離體遞送至受試者的 細(xì)胞。
[0075] 合適的啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是立即早期巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序 列是能夠驅(qū)動(dòng)可操作地連接其的任何多核苷酸序列的高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列。 合適的啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例是延伸生長因