專利名稱：一種針對(duì)t細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備方法，尤其是一種通過正反篩選法獲得特異性單克隆抗體的方法。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞通過其表面T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物分子(Major histocompatibility complex, MHC)呈遞的多肽來行使其細(xì)胞功能，所以 TCR的識(shí)別能力是T細(xì)胞行使功能的先決條件。與抗體分子一樣，TCR組成鏈的形成也存在基因重排現(xiàn)象，即每條多肽鏈的編碼基因都是由3個(gè)或4個(gè)基因片段組合而成。其中，短鏈 α和Y是由可變區(qū)基因片段(V gene segment)、連接子基因片段(J gene segment)和恒定區(qū)基因片段(C gene segment)三種片段連接而成，而長(zhǎng)鏈β和δ是由4個(gè)基因片段組合而成，包括與短鏈一樣的3個(gè)基因片段和額外的多樣性基因片段(D gene segment)。每個(gè)基因片段的相互連接處都存在核苷酸的隨機(jī)缺失或增加，從而造成連接處的高度多樣性。舉例而言，人染色體上共含有42個(gè)Va基因片段和46個(gè)νβ基因片段，以及數(shù)目龐大的連接子基因片段J α或J0，加上基因重排時(shí)基因片段連接處的高度多樣性，就使得α β TCR庫的數(shù)目高達(dá)IOw個(gè)。我們知道，對(duì)于其他類型的細(xì)胞受體而言，沒有一種細(xì)胞受體能和TCR 一樣具有如此多的多樣性。所以我們可以想象，TCR與其配體之間的識(shí)別將比其他任何一種細(xì)胞受體都要復(fù)雜和奇妙。TCR主要通過其可變區(qū)的6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)域(Complementarity determining region,⑶R)來與配體發(fā)生相互作用，所以可變區(qū)決定TCR的識(shí)別能力。而在病原抗原特異性或腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞受體庫研究中，我們往往會(huì)發(fā)現(xiàn)某些可變區(qū)基因片段會(huì)占優(yōu)勢(shì)，存在偏好性，而監(jiān)測(cè)這些帶有優(yōu)勢(shì)可變區(qū)基因片段的T細(xì)胞受體的變化情況對(duì)于我們?cè)O(shè)計(jì)和開發(fā)基于T細(xì)胞的相關(guān)疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。目前成熟應(yīng)用的監(jiān)測(cè)方法就是流式細(xì)胞儀技術(shù)，而要想應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)必然需要用到特異性的單克隆抗體。但是到目前為止，依然沒有一種通用的方法來生產(chǎn)針對(duì)T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單克隆抗體的制備方法，本專利旨在提供一種能夠有效生產(chǎn)該類單克隆抗體的方法，并申請(qǐng)保護(hù)。本發(fā)明通過體外復(fù)性技術(shù)獲得可溶性T細(xì)胞受體蛋白，接著應(yīng)用單克隆抗體雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗，并采用正反篩選法來獲得某可變區(qū)特異性的單抗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種針對(duì)T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為首先制備可溶性T細(xì)胞受體蛋白，然后采用正反篩選獲得可產(chǎn)特異性可變區(qū)單抗的雜交瘤株。所述可溶性T細(xì)胞受體蛋白制備過程中通過引入人工二硫鍵穩(wěn)定T細(xì)胞受體蛋白，所述人工二硫鍵由α鏈恒定區(qū)的Τ48 - C和β鏈恒定區(qū)的S57 _ C組成。為了更好的穩(wěn)定T細(xì)胞受體蛋白，可同時(shí)將β鏈中的自由半胱氨酸突變成丙氨
所述正反篩選的原理如下T細(xì)胞受體胞外段由4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，包括兩個(gè)可變區(qū)和兩個(gè)恒定區(qū)。所以當(dāng)我們采用T細(xì)胞受體蛋白去免疫小鼠生產(chǎn)單抗時(shí)，我們得到的單抗有可能結(jié)合目標(biāo)可變區(qū)外的其它三個(gè)結(jié)構(gòu)域。為了高效獲得目標(biāo)可變區(qū)特異性的單抗，我們還要采用反篩法剔除那些不結(jié)合目標(biāo)可變區(qū)的單抗。其具體步驟如下首先利用T細(xì)胞受體蛋白1免疫小鼠生產(chǎn)單抗，將能夠結(jié)合T細(xì)胞受體1的單抗雜交瘤株留下；然后使用τ細(xì)胞受體2篩選將第1)步獲得的單抗雜交瘤株，將不能結(jié)合T細(xì)胞受體2的單抗雜交瘤株留下，得到可產(chǎn)特異性可變區(qū)1單抗的雜交瘤株；所述T細(xì)胞受體1與T細(xì)胞受體2的區(qū)別就在于目標(biāo)可變區(qū)的不同，而其它三個(gè)結(jié)構(gòu)域都相同。應(yīng)用本方法可以高效、快速的獲得T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗，對(duì)設(shè)計(jì)和開發(fā)基于T細(xì)胞的相關(guān)疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。


圖1單克隆抗體檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1可溶性T細(xì)胞受體蛋白改造
以篩選V δ 1可變區(qū)(也叫TRDV1，TCR可變區(qū)信息請(qǐng)參考網(wǎng)站http://www. imgt. org) 的特異性單抗為例，我們來說明具體的實(shí)施方式。其中，我們用于正篩的T細(xì)胞受體1為 S19-2，來源于HIV病人，識(shí)別的配體是HLA-AM402限制性的nef 138-10表位(來源于HIV 病毒nef蛋白)。所有蛋白材料可由基因合成公司合成相應(yīng)基因來表達(dá)。HLA-A*2402的序列信息如SEQ ID NO. 1所示，具體如下 GSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDEETGKVKAHSQ
TDRENLRIALRYYNQSEAGSHTLQMMFGCDVGSDGRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQITKRKWEA AHVAEQQRAYLEGTCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCffALGFYPAEITLTffQRDGEDQTQ DTELVETRPA⑶GTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRW
Nefl38-10表位多肽可由公司合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具體如下 為 RYPLTFGWCF。S19-2 TCR 兩條鏈的基因組成信息為α 鏈，TRDVl+TRAC ； β 鏈，TRBV30+TRBC。α鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示，具體如下 MLFSSLLCVFVAFSySGSSVAQMTQAQSSYSMPYRMYTWCLYETSmSYYIFmmiPSKEMIFLmQG
SDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGELARSGGYQKVTFGTGTKLQVIPAyaV/ K7^ RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAVSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFP ^^CDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLffSS
其中，帶有下劃線的部分為可變區(qū)序列，帶有下劃線且斜體字體部分為恒定區(qū)序列，位于可變區(qū)和恒定區(qū)之間的為高度可變的連接區(qū)序列。恒定區(qū)序列中的T48突變成C，用于后期的復(fù)性過程中可引入一對(duì)人工二硫鍵來穩(wěn)定TCR蛋白的構(gòu)象。β鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 4所示，具體如下MLRSLLALLLGTFFGVRSQTIHQffPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYffYRQAAGRGLQLLFYSVGIG QISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSVSVGAGVPTIYFGEGSWLTVWi^MT/y/^^K/^ PSEAEISHTOKA TL VCLA TGFFPDHVELSVVVNGKEVHSGVSTDPOPLKEOPALNDSRYCLSSRLRVSA TFVONPR mFffCOVOFyGLSBMIBWWDMKPVWIVSABAWGMDCGFTSYSYQQGYLSATILYEILLGMTLYAYUSAU LMAMVKRKDF
其中，帶有下劃線的部分為可變區(qū)序列，帶有下劃線且斜體字體部分為恒定區(qū)序列， 位于可變區(qū)和恒定區(qū)之間的為高度可變的連接區(qū)序列，恒定區(qū)之后的為跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列。恒定區(qū)序列中的S57需要突變成C，用于后期的復(fù)性過程中可引入一對(duì)人工二硫鍵來穩(wěn)定TCR蛋白的構(gòu)象，同時(shí)將自由半胱氨酸C96突變成A，減少復(fù)性過程中多聚體的形成。用于反篩法的T細(xì)胞受體2是在S19-2的基礎(chǔ)上，將α鏈的可變區(qū)TRDVl替換成 TRAV2-1，而β鏈保持不變，這個(gè)T細(xì)胞受體我們命名為S19-2-TRAV2-1。新組合而成的α 鏈蛋白序列如SEQ ID NO. 5所示，具體如下(僅包括可變區(qū)，連接區(qū)和恒定區(qū)序列)
KEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSN⑶KEDGRFTAQLNKASQYVS LLIRDSQPSDSATYLCAVTLARSGGYQKVTFGTGTKLQVIPAyaV/^/^KFa^taSSy^ZMyKa/TiFiASWWSg SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAVSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS
將這三條多肽鏈構(gòu)建到表達(dá)載體pET21a上，具體實(shí)驗(yàn)操作請(qǐng)見《分子克隆技術(shù)手冊(cè)》。 應(yīng)用大腸桿菌E. coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)包涵體蛋白并純化，具體步驟如下
1)將1-2 yL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，過夜，將單克隆菌落接種到 40 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6-8小時(shí)。2)每20 mL分別按照1%的接種量轉(zhuǎn)接到含有2 L LB培養(yǎng)基的大搖瓶中，37°C培養(yǎng)至0D600=0. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mM，37°C繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)。3)收菌(以下步驟都在低溫或冰水浴下進(jìn)行)，用60 mL左右IXPBS懸浮，Φ6探頭超聲裂解(超聲6 s，間隔12 s，99次，250 W，2個(gè)循環(huán))。4) 17500 rpm，離心15 min。離心管下部呈白色致密塊即為包涵體。5)用移液器或玻璃棒小心的將包涵體上面一層細(xì)胞脆片吹打掉，棄上清。用 Washing buffer 懸浮。6)超聲，4 S, 10 S, 40 次，250 W。7)重復(fù)步驟4-6，用Washing buffer洗滌三次。8) Resuspension buffer17500 rpm, 15 min。9)除細(xì)胞碎片、棄上清，稱重。按30mg/mL的比例用包涵體溶解液(Disolution buffer)溶解，4°C攪拌過夜。10) 17500 rpm, 20 min，取出上清或分裝成ImL/管保存于_20°C或_80°C備用。包涵體清洗液(Washing buffer):0. 5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8. 0,300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現(xiàn)用現(xiàn)加)；
包涵體重懸液(Rsuspension buffer) :50 mM Tris pH 8. 0,100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現(xiàn)用現(xiàn)加)；
包涵體溶解液(Dissolution buffer) 6 M Gua-HCl (或 8 M Urea)，10%甘油，50mM Tris pH8. 0,100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT (現(xiàn)用現(xiàn)加)； 實(shí)施例2可溶性T細(xì)胞受體蛋白的復(fù)性具體步驟如下
1)配制TCR復(fù)性液。一般為2 L，于冰上或4°C冷庫預(yù)冷，復(fù)性過程在4°C冷庫中進(jìn)行。2)將盛有復(fù)性液的燒杯置于磁力攪拌器中，加入轉(zhuǎn)子，設(shè)置合適的攪拌速度。這里以Isec轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)一圈為佳。找一個(gè)5 mL注射器換上1 mL的針頭，將其固定在燒杯上。3) α鏈和β鏈的包涵體按照2:1的質(zhì)量比加入注射器(質(zhì)量比例根據(jù)實(shí)際復(fù)性情況可進(jìn)行調(diào)整)，即一次加入2 mL α鏈和1 mL β鏈，并混勻。使之一滴一滴的緩慢滴入復(fù)性液內(nèi)，慢慢攪拌8小時(shí)。4)每隔8小時(shí)，重復(fù)一次步驟4，一共加三次包涵體，即一共加入6 mL的α鏈和 3 mL β 鏈。5)第三次加完包涵體后8小時(shí)，使用切向流儀器(TFF)進(jìn)行濃縮，最后溶液體系為約300-400 mL，將濃縮后的蛋白復(fù)性溶液放入透析袋。6)復(fù)性液濃縮過程中，準(zhǔn)備4 L去離子水和4L 10 mM Tris緩沖液，4°C冷庫預(yù)冷。7)先將裝入透析袋的蛋白在水中透析M小時(shí)，再用10 mM Tris透析對(duì)小時(shí)，透析過程中需用轉(zhuǎn)子攪拌。8)將透析后的蛋白液放入濃縮杯濃縮至100 mL。9)取出蛋白液，4°C，16，000 rpm離心10分鐘。取上清。10)用離子交換柱Source 15Q純化，先分多次上樣將蛋白結(jié)合到離子交換柱上， 每次5ml，一般上滿50 mL蛋白就洗脫一次，用鹽濃度梯度洗脫，梯度一般為90分鐘內(nèi)從0% 拉到50%ο11)跑非還原和還原蛋白膠確定目的TCR蛋白峰，此后將所收集的蛋白用 Superdex 200柱子再次純化。復(fù)性液配方如下 5M Urea
IOOmM Tris pH8. 0
400mM L-Arg HCl (母液可配成 2M)
2mM EDTA
5mM GSH (復(fù)性液預(yù)冷后再加入)
0. 5mM GSSG (同上)
0. 5mM PMSF (母液 IOOmM,可不加)。實(shí)施例3正反篩選制備特異性單克隆抗體
T細(xì)胞受體胞外段由4個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，包括兩個(gè)可變區(qū)和兩個(gè)恒定區(qū)。所以當(dāng)我們采用T細(xì)胞受體蛋白去免疫小鼠生產(chǎn)單抗時(shí)，我們得到的單抗有可能結(jié)合目標(biāo)可變區(qū)外的其它三個(gè)結(jié)構(gòu)域。為了高效獲得目標(biāo)可變區(qū)特異性的單抗，我們還要采用反篩法剔除那些不結(jié)合目標(biāo)可變區(qū)的單抗。所謂反篩法，首先需要我們應(yīng)用體外復(fù)性技術(shù)構(gòu)建一種用于反篩的T細(xì)胞受體蛋白2，同時(shí)為了方便陳述，我們將之前免疫小鼠的T細(xì)胞受體蛋白命名為T細(xì)胞受體1。T細(xì)胞受體1與T細(xì)胞受體2的區(qū)別就在于目標(biāo)可變區(qū)的不同，而其它三個(gè)結(jié)構(gòu)域都相同。制備流程如下首先我們利用T細(xì)胞受體1免疫小鼠生產(chǎn)單抗，之后采用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)) 技術(shù)來正反篩選所要的某可變區(qū)特異性單抗。第一步，正向篩選，將能夠結(jié)合T細(xì)胞受體1 的單抗雜交瘤株留下；第二步，在第一步獲得的單抗雜交瘤株中，進(jìn)一步用T細(xì)胞受體2反向篩選，即將不能結(jié)合T細(xì)胞受體2的單抗雜交瘤株留下，剔除那些能夠與T細(xì)胞受體2結(jié)合的單抗雜交瘤株。經(jīng)過這兩步正反篩選獲得的單抗雜交瘤株就是我們最后所要的某可變區(qū)特異性單抗。還是以篩選V δ 1特異性單抗為例，我們通過實(shí)施例2里的方法獲得可溶性T細(xì)胞受體1和τ細(xì)胞受體2以后，進(jìn)行上述的制備流程。結(jié)果我們共獲得11株單抗雜交瘤株， 采用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。操作步驟 1)包被
用包被緩沖液將蛋白稀釋至lOug/mL，每孔中加入0. lmL，先置37°C孵育2小時(shí)再轉(zhuǎn)入 4°C過夜。也可以將ELISA板直接置4°C過夜。2)洗滌
包被結(jié)束后棄掉包被液，用PBST進(jìn)行洗滌，方法為PBST加滿每孔，靜置5-lOmin，棄掉洗液，重新加滿，重復(fù)洗滌3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封閉。3)封閉
取第2步的ELISA板加10%小牛血清至每孔封閉，體積至少為所加包被液的兩倍。封閉條件也有兩種選擇直接置于4°C過夜，或者置于37°C溫育2-4h。4)洗滌
封閉結(jié)束的ELISA板進(jìn)行洗滌，方法同步驟2。最后拍干等待加入一抗(單抗雜交瘤株培養(yǎng)細(xì)胞上清或小鼠腹水純化單抗)。5)加入一抗
一抗樣品先用包被液稀釋至所需濃度后加入到相應(yīng)孔中。反應(yīng)條件為37°C孵育池。6)洗滌具體同步驟4。7)加相應(yīng)HRP-標(biāo)記的商品化二抗
加相應(yīng)的商品化HRP-標(biāo)記的二抗，參考二抗說明書將二抗用封閉液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)。 將稀釋好的二抗加入各孔，37°C反應(yīng)1-1.證。8)洗滌具體同步驟4。9)顯色
待步驟8完成后取lOOulTMB底物顯色液分加至ELISA各孔中。然后將ELISA板置于 37°C 反應(yīng)約 IOmin。10)終止
將ELISA板取出，每孔加終止液(2mol/L硫酸溶液)終止反應(yīng)，立即到酶標(biāo)儀上讀數(shù)， TMB為底物時(shí)波長(zhǎng)為450nm。試劑配制
1)包被液(PH6. 3的碳酸鹽緩沖液)無水 Na2C03 0. 1696g NaHC030.2856g
無菌水100ml
完全溶解至4°C，一周內(nèi)使用
2)PBST配方
NaCl8.Og
Na2HP04. 12H20 2. 9g KCl0. 2g
KH2P040. 24g
Tff-200. 5ml
無菌水1000ml
3)終止液
濃硫酸無菌水=1:8
濃硫酸緩慢加入到無菌水中，并攪拌散熱。最后我們獲得ELISA數(shù)據(jù)如圖1所示。結(jié)果顯示其中10株都能特異性地結(jié)合V 6 1 可變區(qū)，而有一株不能特異性地結(jié)合。所以應(yīng)用我們的方法能夠高效率的獲得某可變區(qū)特 異性單抗，并保證識(shí)別蛋白的活性構(gòu)象表位，可用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗的制備方法，其特征在于首先制備可溶性T 細(xì)胞受體蛋白，然后采用正反篩選獲得可產(chǎn)特異性可變區(qū)單抗的雜交瘤株。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述可溶性T細(xì)胞受體蛋白中通過引入人工二硫鍵穩(wěn)定T細(xì)胞受體蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述人工二硫鍵由α鏈恒定區(qū)的T48-C和β 鏈恒定區(qū)的S57-C組成。
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于還包括同時(shí)將β鏈中的自由半胱氨酸突變成丙氨酸。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述正反篩選包括如下步驟1)利用T細(xì)胞受體蛋白1免疫小鼠生產(chǎn)單抗，將能夠結(jié)合T細(xì)胞受體1的單抗雜交瘤株留下；2)使用T細(xì)胞受體2篩選將第1)步獲得的單抗雜交瘤株，將不能結(jié)合T細(xì)胞受體2的單抗雜交瘤株留下，得到特異性產(chǎn)T細(xì)胞受體可變區(qū)1單抗的雜交瘤株；所述T細(xì)胞受體1 與T細(xì)胞受體2的區(qū)別就在于目標(biāo)可變區(qū)的不同，而其它三個(gè)結(jié)構(gòu)域相同。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種針對(duì)T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗的制備方法，首先制備可溶性T細(xì)胞受體蛋白，然后采用正反篩選獲得可產(chǎn)特異性可變區(qū)單抗的雜交瘤株。應(yīng)用本方法可以高效、快速的獲得T細(xì)胞受體可變區(qū)特異性單抗，對(duì)設(shè)計(jì)和開發(fā)基于T細(xì)胞的相關(guān)疫苗和免疫治療手段具有重要的意義。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102295702SQ201110247320
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者施一, 高福 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所