胞的菌懸液每毫升加入20mg連二亞硫酸鈉，然后分 為等體積2份，一份通入一氧化碳氣體5min作為樣品，另一份通入空氣作為對照樣品。首 先在分光光度計中掃描對照樣品400-500nm的光吸收值，然后掃描樣品400-500nm的光吸 收值，相應波長處兩樣品光吸收的差值即為差光吸收值，以差光吸收值為縱坐標，對應的波 長為橫坐標，所得曲線即為樣品的一氧化碳差光光譜圖。與通入空氣的對照樣品相比，通入 C0氣體以后，重組菌能夠在420nm左右的波長下產(chǎn)生光吸收，這與典型的透明顫菌血紅蛋 白特征吸收曲線相符，而原始菌沒有特征吸收峰，如圖5所示。結果表明重組菌中密碼子優(yōu) 化后的透明顫菌血紅蛋白基因具有表達活性。
[0083] 實施例4
[0084] 5L發(fā)酵罐對比實驗。
[0085] 5L發(fā)酵罐中裝液量2. 8L，將原始菌和重組菌株經(jīng)過活化，進行種子培養(yǎng)后，按照 接種量8%進行接種，37°(：培養(yǎng)，轉速55(^/1^11，通氣量3171^11，用氨水連續(xù)流加控制？!1為 7. 0-7. 2,培養(yǎng)60h，發(fā)酵期間，在達到穩(wěn)定期后，每當發(fā)酵液的溶氧低于30 %時，加入23g木 糖，兩次添加的時間間隔為4h。發(fā)酵實驗進行15次重復實驗，取平均值進行比較。
[0086] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖1% (115°C單獨滅菌20min)，酵母膏1%，玉米淀粉2%，氯化 鈉1%，磷酸二氫鉀3%，其余是水；pH6. 8. 0-7. 1，121°C滅菌20min，裝液量25/250ml三角 瓶；
[0087] 發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉9 %，豆餅粉3 %，玉米漿1 %，硫酸銨2 %，磷酸二氫鉀8%，硫 酸鎂0. 3%，氯化鈣1%，其余是水；pH6. 8. 0-7. 1，121°C滅菌20min，裝液量2. 8L/5L。
[0088] 實施例5
[0089] 中溫α-淀粉酶的酶活及最終產(chǎn)量的測定。
[0090] (1)酶活單位定義：lg固體酶粉（或者lmL液體酶），于60°C、pH= 6. 0條件下， lh液化lg可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以u/g(u/mL)表示。
[0091] (2)原理：α-淀粉酶制劑能將淀粉分子鏈中的α-1，4-葡萄糖苷鍵隨機切斷成長 短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘呈籃紫色的特性反應逐漸消失，呈 現(xiàn)棕紅色，其顏色消失的速度與酶活性有關，據(jù)此可通過反應后的吸光度計算酶活力。
[0092] (3)試劑和溶液
[0093] 原碘液：稱取11. 0g碘和22. 0g碘化鉀，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，貯 存于棕色瓶中。
[0094] 稀碘液：吸取原碘液2.OOmL，加20. 0g碘化鉀用水溶解并定容至500mL，貯存于棕 色瓶中。
[0095] 可溶性淀粉溶液（20g/L):稱取2. 000g(精確至0· 001g)可溶性淀粉（以絕干計） 于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀 粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至l〇〇mL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。（注： 可溶性淀粉可采用湖州展望化學藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶制劑專用可溶性淀粉。）
[0096] 磷酸緩沖液（pH= 6. 0):稱取45. 23g磷酸氫二鈉和8. 07g檸檬酸，用水溶解并定 容至1000mL。用pH計校正后使用。
[0097]鹽酸溶液[c(HCl) = 0·lmol/L]:按GB/T601 配制。
[0098] (4)儀器和設備
[0099] 恒溫水浴鍋：控溫精度±0· 1 °C。
[0100] 分光光度計。
[0101] 自動移液器。
[0102] 試管：25mm*200mm。
[0103]秒表。
[0104] (5)分析步驟
[0105] 待測酶液的制備：精確吸取酶液1. 00mL，用少量磷酸緩沖液充分溶解，將上清液 小心傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量 瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過濾，濾液待用。（注：待測中溫α-淀 粉酶酶液活力控制酶液濃度在3. 4u/mL-4. 5mL范圍內(nèi)。）
[0106] 測定：吸取20.OmL可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液5. 00mL，搖勻后，置 于60°C±0. 2°C恒溫水浴中預熱8min;加入1. 00mL稀釋好的待測酶液，立即計時，搖勾，準 確反應5min;立即用自動移液器吸取1. 00mL反應液，加到預先盛有0. 5mL鹽酸和5.OmL稀 碘液的試管中，搖勾，并以〇. 5mL鹽酸溶液和5.OmL稀碘液為空白，于660nm波長下，用10mm 比色皿迅速測定其吸光度（A)。根據(jù)吸光度表A. 1(GB8275-2009中表A. 1)，求得測試酶液 的濃度。
[0107]計算：
[0108] 中溫α-淀粉酶制劑的酶活力按下式計算：
[0109] X = c*n，
[0110] 式中：x-樣品的酶活力，u/mL活u/g;
[0111] c-測試酶樣濃度，u/mL活u/g;
[0112] η-樣品的稀釋倍數(shù)。
[0113] 所得結果表示至整數(shù)。
[0114] (6) 5L罐產(chǎn)量的測定結果
[0115] 測定15個批次發(fā)酵實驗的最終酶活單位，在最終發(fā)酵體積一致的情況下，其中原 始菌的發(fā)酵液平均酶活單位為513u/mL，重組菌的發(fā)酵液平均酶活單位為2068u/mL，重組 菌株中溫α-淀粉酶的產(chǎn)量較原始菌株提高了 303%。
【主權項】
1. 一種透明顫菌血紅蛋白突變體，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。2. -種透明顫菌血紅蛋白突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示。3. 權利要求1所述透明顫菌血紅蛋白突變體的用途，其特征在于，用于提高受體菌細 胞對氧氣的利用率。4. 一種包含權1所述突變體的克隆載體、表達載體或宿主細胞。5. 如權利要求4所述的克隆載體、表達載體或宿主細胞，其特征在于，所述的克隆載體 為PMD18-T，所述的表達載體為PBE-Pxyl，所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌。6. -種包含權利要求1所述血紅蛋白突變體的重組枯草芽孢桿菌，其保藏編號為 CGMCCNo. 10787。7. 權利要求書7所述重組枯草芽孢桿菌的用途，其特征在于，用于發(fā)酵生產(chǎn)中溫α-淀 粉酶，所述中溫α-淀粉酶的酶活力比原始菌株提高300%以上。8. 利用權利要求6所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中溫α-淀粉酶的方法，其特征在 于，發(fā)酵培養(yǎng)基組成：玉米粉9 %，豆餅粉3 %，玉米漿1 %，硫酸銨2 %，磷酸二氫鉀8 %，硫 酸鎂0. 3%，氯化鈣1%;ρΗ6. 8. 0-7. 1，121°C滅菌20min，裝液量2. 8L/5L;5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條 件：發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量2. 8L，接種量8%，37°C培養(yǎng)，轉速550r/min，通氣量3L/min，用氨水 連續(xù)流加控制pH為7. 0-7. 2,培養(yǎng)60h，發(fā)酵期間，在達到穩(wěn)定期后，每當發(fā)酵液的溶氧低于 30%時，加入23g木糖，兩次添加的時間間隔為4h。9. 如權利要求8所述的發(fā)酵生產(chǎn)中溫α-淀粉酶的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐發(fā)酵前 所述重組枯草芽孢桿菌還經(jīng)過種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基為：葡萄糖1% 115°C單獨滅菌20min， 酵母膏1 %，玉米淀粉2 %，氯化鈉1 %，磷酸二氫鉀3 % ;pH6. 8. 0-7. 1，121°C滅菌20min，裝 液量25/250ml三角瓶；種子培養(yǎng)條件：于固體培養(yǎng)基平板中挑選枯草芽孢桿菌單菌落接種 于種子培養(yǎng)基中，180r/min，37°C培養(yǎng)25h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株可控表達密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白突變基因的重組枯草芽孢桿菌及其應用，所述菌株為重組枯草芽孢桿菌(Bacillus？subtilis/PBE-Pxyl-vgb)，保藏編號為CGMCC？No.10787。利用密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白突變基因vgh，構建枯草芽孢桿菌表達載體PBE-Pxyl-vgb；將該表達載體PBE-Pxyl-vgb電轉入枯草芽孢桿菌中，獲得了重組枯草芽孢桿菌(PBE-Pxyl-vgb)。利用此菌株生產(chǎn)中溫α-淀粉酶時，按照實際發(fā)酵過程的需要加入或者不加木糖，來啟動或者關閉透明顫菌血紅蛋白的表達，實現(xiàn)透明顫菌血紅蛋白基因的可控表達，避免了一直表達此蛋白對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的過多消耗，因而提高了重組枯草芽孢桿菌對氧的利用效率。結果顯示，重組枯草芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶的發(fā)酵水平比原始菌株提高了303％。CGMCC No.1078720150507
【IPC分類】C07K14/805, C12R1/125, C12N1/21, C12N15/75, C12N15/31, C12N9/28
【公開號】CN105348384
【申請?zhí)枴緾N201510865888
【發(fā)明人】王興吉, 郭慶文, 佟新偉
【申請人】山東隆科特酶制劑有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月1日