副腫瘤性天皰瘡的抗原evpl-l3及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物
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，尤其涉及副腫瘤性天皰瘡的抗原EVPL-L3及其應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]副腫瘤性天皰瘡是一種自身免疫性大皰性皮膚病，包斑蛋白和周斑蛋白是患者血清中抗體識別率最高的主要抗原。篩選出其抗原表位有利于臨床上建立高敏感度及特異度的診斷方法，同時有利于科研上進一步深入研究其發(fā)病機制。副腫瘤性天皰瘡伴發(fā)多種淋巴系統(tǒng)來源腫瘤，國外報道半數(shù)以上為非霍奇金淋巴瘤，而我國與國外伴發(fā)的腫瘤譜明顯不同，伴有Castleman病的副腫瘤性天皰瘡患者占多數(shù)，因此篩選并找到副腫瘤性天皰瘡中國患者獨特的抗原表位對我國患者的診治和預(yù)后具有重大的臨床意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0003]本發(fā)明的一個目的是提供副腫瘤性天皰瘡的抗原EVPL-L3。[0004]本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，命名為EVPL-L3,是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：[0005]a)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；[0006]b)由序列表中序列6第6-106位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；[0007]c)將a)或b)所示的序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。[0008]上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。[0009]編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子也是本發(fā)明保護范圍。[0010]上述DNA分子為如下1)-4)中任一種DNA分子：[0011]1)編碼區(qū)為序列表中序列5所示的DNA分子；[0012]2)編碼區(qū)為在序列表中序列5第16-318位所示的DNA分子；[0013]3)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子；[0014]4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子。[0015]上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0·1%SDS和1XSSC，0·1%SDS各洗膜一次。[0016]上述蛋白質(zhì)或上述DNA分子在制備診斷或輔助診斷待測人是否患有副腫瘤性天皰瘡產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。[0017]上述產(chǎn)品為試劑盒。[0018]本發(fā)明的另一個目的是提供一種診斷或輔助診斷待測人是否患有副腫瘤性天皰瘡的試劑盒。[0019]本發(fā)明提供的試劑盒，包括抗原，所述抗原為序列2第6-106位所示的蛋白與標(biāo)簽連接后的融合蛋白。[0020]所述抗原為序列2;[0021]所述試劑盒還包括抗所述標(biāo)簽的抗體和二抗；[0022]上述試劑盒為間接酶聯(lián)免疫試劑盒。[0023]結(jié)合所述抗原的抗體為鼠源抗his標(biāo)簽抗體；[0024]結(jié)合所述抗體的二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人IgG。[0025]上述的試劑盒在制備診斷或輔助診斷待測人是否患有副腫瘤性天皰瘡產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。[0026]本發(fā)明的實驗證明，采用重組EVPL-L3作為檢測抗原，酶聯(lián)免疫吸附實驗對66例副腫瘤性天皰瘡患者和50例正常志愿者血清樣本進行檢測敏感度74.2%(49/66)，特異性92%。因此，證明重組EVPL-L3是副腫瘤性天皰瘡主要表位并可輔助診斷?！靖綀D說明】[0027]圖1為包斑蛋白模式圖及EVPL-L3的位置。[0028]圖2為純化后的EVPL-L3重組蛋白與His標(biāo)簽抗體行免疫印跡鑒定結(jié)果。[0029]圖3為EVPL-L3的R0C曲線分析后結(jié)果?！揪唧w實施方式】[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0031]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0032]pH值為9.6濃度為0·05M的碳酸鹽緩沖液（CBS):1.59g碳酸鈉（北京化工廠S0148)和2.93g碳酸氫鈉（北京化工廠S0037)，溶于1L去離子水（millipore水機自制），0·45um濾器（milliporeSLHV033RB)過濾，調(diào)節(jié)pH值，得到pH值為9.6濃度為0·05M的CBS〇[0033]pH值為7.5濃度為0·02M的PBST:將PBS粉劑（北京中杉金橋生物公司ZLI-9062)和Tween20(Amresco0777)溶于2L去離子水，PBS粉劑的濃度0.02M，Tween20的體積百分含量為〇.05%，調(diào)節(jié)pH值，得到pH值為7.5濃度為0.02M的PBST。[0034]封閉液：將脫脂奶粉加入上述pH值為7.5濃度為0.02M的PBST中得到的溶液，使脫脂奶粉的質(zhì)量百分含量為5%。[0035]實施例1、原核表達(dá)EVPL-L3[0036]一、EVPL-L3的篩選[0037]針對包斑蛋白（Envoplakin，EVPL)的連接亞區(qū)（aal543_aal784)設(shè)計了三個相互重疊十多個氨基酸的片段。借助DNAstar軟件，綜合考慮抗原性（Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、親水性（Antigenicity)后，將其分為3段，分別是EVPL-L1(aal543_aal645)，EVPL-L2(aal610-aal717)，EVPL-L3(aal684-aal784);見圖1。[0038]其中，EVPL-L1蛋白的氨基酸序列為序列2第6-108位氨基酸，其編碼基因的核苷酸序列為序列1第16-324位核苷酸；[0039]EVPL-L2蛋白的氨基酸序列為序列4第6-113位氨基酸，其編碼基因的核苷酸序列為序列3第16-339位核苷酸；[0040]EVPL-L3蛋白的氨基酸序列為序列6第6-106位氨基酸，其編碼基因的核苷酸序列為序列5第16-318位核苷酸。[0041]二、原核表達(dá)EVPL-L3[0042]1、重組載體的構(gòu)建[0043]將序列5第16-318位核苷酸所示的EVPL-L3蛋白編碼基因插入pEASY-E2表達(dá)載體（全式金生物有限公司CE201-01)進行平端連接，得到的重組載體，命名為PEASY-E2-EVPL-L3,實現(xiàn)EVPL-L3蛋白與載體上的MGIGP和KGQFLEHHHHHΗ(Η是his的簡寫）標(biāo)簽共表達(dá)，得到重組EVPL-L3。[0044]重組EVPL-L3的氨基酸序列為序列6,第1-5位為載體上的氨基酸，第6-106位為EVPL-L3蛋白，第107-118位為his標(biāo)簽；[0045]重組EVPL-L3的編碼基因的核苷酸序列為序列5,第1-15位為載體上的MGIGΡ編碼核酸，第16-318位為EVPL-L3蛋白編碼基因，第319-357位為his標(biāo)簽編碼基因。[0046]2、重組克隆感受態(tài)的構(gòu)建[0047]將重組載體pEASY-E2-EVPL-L3導(dǎo)入大腸桿菌Transl-Tl(全式金生物有限公司CD5010-01)中，得到重組菌Transl-Tl-EVPL-L3。[0048]提取重組菌的質(zhì)粒送去測序，質(zhì)粒為pEASY-E2-EVPL-L3的為陽性重組質(zhì)粒。[0049]3、重組EVPL-L3蛋白表達(dá)[0050]將上述的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell(全式金生物有限公司⑶801-01)，在固態(tài)LB上挑取單克隆后搖菌，分裝凍存。復(fù)蘇表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后1:50接種至液態(tài)LB，37°C，200rpm/min，搖至0D600=0·6,加入終濃度0·05mM的誘導(dǎo)劑IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosi(^，全式金生物有限公司6?101-01)，37°(：，200印111/1^11，誘導(dǎo)5小時。4°(：，10000印111離心10min收集菌體，并重懸至含蛋白酶抑制劑（羅氏CompletetabletsEDTA_free，EASYpack04693132001)的結(jié)合緩沖液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8.0)中，得到菌體懸浮液。[0051]4、純化重組EVPL-L3蛋白[0052]菌體懸浮液用超聲破碎儀裂解（300W功率，超聲5s停10s，持續(xù)20min)菌體，4°C，14000g，20min離心，取上清0.45um濾器過濾，加入咪唑，使其終濃度為10mM/L，使用鎳柱親和層析技術(shù)純化，將準(zhǔn)備好上清加入鎳柱（Ni-NTAHisBindResins默克公司70666-3,流速lml/min)4°C，lOOrprn，搖1小時，含20mM咪唑的漂洗緩沖液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8.0,20mM咪唑）當(dāng)前第1頁1 2