為親水性，或涂布足夠量的粘附因子，例如纖連蛋白等。作為使培養(yǎng)容器1內(nèi)為親水性的方法，例如可以舉出使用進(jìn)行了 UV臭氧處理或電暈處理的膜來(lái)制成培養(yǎng)容器1。作為涂布粘附因子的方法，例如可以舉出用粘附因子的溶液浸漬培養(yǎng)容器1內(nèi)，并保持給定時(shí)間，由此使粘附因子吸附在培養(yǎng)容器1內(nèi)面的方法。
[0048]此外，在培養(yǎng)容器1中，具備一個(gè)或兩個(gè)以上的用于進(jìn)行培養(yǎng)液2及粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的取放的口(示一卜)。
[0049]培養(yǎng)液2只要是可以培養(yǎng)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的培養(yǎng)液即可，可以使用現(xiàn)有的培養(yǎng)液。例如可以合適地使用在DMEM(杜爾伯科/沃格特改良伊格爾最低必需培養(yǎng)基)中加入了 FBS (胎牛血清)10%的培養(yǎng)液等。
[0050]粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3只要是附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)增殖的細(xì)胞，就沒(méi)有特別限定，例如可以使用iPS細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞等。
[0051]裝載臺(tái)4是在其上表面載放培養(yǎng)容器1的平面的臺(tái)。在裝載臺(tái)4中，例如可以設(shè)置用于將培養(yǎng)容器1固定在裝載臺(tái)4的固定件等、用于安置培養(yǎng)容器1的各種構(gòu)成。
[0052]推壓構(gòu)件5是通過(guò)從培養(yǎng)容器1的外部推壓培養(yǎng)容器1，而使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面相面對(duì)的培養(yǎng)容器1的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加壓力的構(gòu)件。
[0053]作為該推壓構(gòu)件5，例如如圖2的(A)所示，可以使用其底面為平面的立體形狀的構(gòu)件。如果使用此種底面為平面的推壓構(gòu)件5-1，則可以將附著于由平面推壓的培養(yǎng)容器1內(nèi)的一定區(qū)域中的膜的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3選擇性并且高效地剝離。作為此種立體形狀，例如可以舉出長(zhǎng)方體、立方體、圓柱、圓錐、多棱柱等形狀。
[0054]另外，作為推壓構(gòu)件5，例如也可以如圖2的⑶所示，使用其底面為曲面(向下方伸出的凸面)的立體形狀的構(gòu)件。如果使用此種底面為曲面的推壓構(gòu)件5-2，則可以將附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)的更小的一定區(qū)域中的膜的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3選擇性剝離。
[0055]此外，作為推壓構(gòu)件5，例如也可以如圖2的(C)所示，使用輥5-3。S卩，從上方用輥推壓培養(yǎng)容器1，使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面相面對(duì)的培養(yǎng)容器1的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加壓力，同時(shí)使輥5-3與裝載臺(tái)4平行地移動(dòng)，由此就可以將附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)的更大的一定區(qū)域中的膜的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3選擇性并且高效地剝離。特別是，為了將培養(yǎng)容器1內(nèi)的全部粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3高效地剝離，作為推壓構(gòu)件5，適合使用輥5-3。
[0056][第二實(shí)施方式]
[0057]下面，參照?qǐng)D3，對(duì)本發(fā)明的第二實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法進(jìn)行說(shuō)明。本實(shí)施方式作為裝載臺(tái)4使用具備孔4-1的構(gòu)件，由此更容易選擇作為剝離對(duì)象的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3。對(duì)于其他的方面，與第一實(shí)施方式相同，對(duì)于培養(yǎng)容器1、培養(yǎng)液2、粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、及推壓構(gòu)件5，可以使用與第一實(shí)施方式相同的材料。
[0058]S卩，本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法中，如圖3所示，作為裝載臺(tái)4，使用在其一定區(qū)域形成有孔4-1的構(gòu)件，將附著于培養(yǎng)容器1的內(nèi)面培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3中的、不想剝離的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1內(nèi)的一定區(qū)域配置于孔4-1上。此后，從培養(yǎng)容器1的外部用推壓構(gòu)件5推壓包括該區(qū)域的范圍，就可以不將附著于該區(qū)域的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3剝離，而僅將附著于該區(qū)域以外的推壓了的范圍的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3選擇性剝離。
[0059]具體而言，在圖3的(1)中，示意性地表示出向包含具有撓曲性的膜的密閉體系的培養(yǎng)容器1 (培養(yǎng)袋)中封入培養(yǎng)液2和粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3并載放在具備孔4-1的裝載臺(tái)4上、將推壓構(gòu)件5配置于培養(yǎng)容器1的上方的樣子。粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3附著在培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面而被培養(yǎng)。
[0060]然后，如圖3的(2)所示，利用推壓構(gòu)件5，從包含孔4-1的范圍的上方推壓培養(yǎng)容器1。此時(shí)，培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的上表面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3，對(duì)于附著于孔4-1的上方以外的區(qū)域的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3，施加不會(huì)損傷粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的程度的壓力。另一方面，附著于孔4-1的上方的區(qū)域的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3當(dāng)被從上方推壓時(shí)，就會(huì)沉入孔4-1中，從而不會(huì)對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加剝離所必需的壓力。
[0061]其結(jié)果是，如圖3的(3)所示，當(dāng)使推壓構(gòu)件5離開(kāi)培養(yǎng)容器1時(shí)，僅使附著于孔4-1的上方以外的區(qū)域的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3從培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面剝落，而附著于孔4-1的上方的區(qū)域的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3不會(huì)從培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面剝落。
[0062]如此所述，根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法，通過(guò)以使不想要?jiǎng)冸x的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3位于裝載臺(tái)4的孔4-1的上方的方式，將培養(yǎng)容器1配置于裝載臺(tái)4，就可以更加細(xì)致地選擇要?jiǎng)冸x的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3。
[0063]而且，雖然孔4-1在圖3中作為貫穿裝載臺(tái)4而形成的孔表示，然而并不限定于此，也可以作為裝載臺(tái)4中的凹陷形成。另外，裝載臺(tái)4的水平面中的孔的形狀也可以是任意的形狀，可以設(shè)為圓形、長(zhǎng)方形、多邊形等以及其他由曲線等構(gòu)成的自由的形狀。此外，其個(gè)數(shù)也不限定為一個(gè)，也可以在裝載臺(tái)4中設(shè)置兩個(gè)以上的孔4-1。
[0064]另外，本實(shí)施方式中也可以不使用推壓構(gòu)件5，而是例如利用空氣壓、液壓等來(lái)推壓包括配置于孔4-1上的區(qū)域的范圍。
[0065][第三實(shí)施方式]
[0066]下面，參照?qǐng)D4對(duì)本發(fā)明的第三實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法進(jìn)行說(shuō)明。本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法通過(guò)將培養(yǎng)容器1內(nèi)設(shè)為負(fù)壓，而使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面相面對(duì)的培養(yǎng)容器1的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加壓力。對(duì)于培養(yǎng)容器1、培養(yǎng)液2、粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、及裝載臺(tái)4，可以使用與第一實(shí)施方式相同的材料。
[0067]S卩，本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法中，通過(guò)從培養(yǎng)容器1內(nèi)排出培養(yǎng)液2，然后抽吸培養(yǎng)容器1的空氣而將培養(yǎng)容器1內(nèi)設(shè)為負(fù)壓，來(lái)使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面相面對(duì)的培養(yǎng)容器1的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加壓力。然后，向培養(yǎng)容器1內(nèi)注入培養(yǎng)液2，將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3從培養(yǎng)容器1的內(nèi)面剝離。
[0068]具體而言，在圖4的(1)中，示意性地表示出向包含具有撓曲性的膜的密閉體系的培養(yǎng)容器1 (培養(yǎng)袋)中封入培養(yǎng)液2和粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并載放在裝載臺(tái)4上的樣子。粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面而被培養(yǎng)。
[0069]然后，如圖4的⑵所示，從培養(yǎng)容器1中排出培養(yǎng)液2，再利用栗等抽吸培養(yǎng)容器1內(nèi)的空氣，將培養(yǎng)容器1內(nèi)設(shè)為負(fù)壓。由此，就使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面相面對(duì)的培養(yǎng)容器1的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3、并對(duì)粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加壓力。
[0070]繼而，如圖4的(3)所示，通過(guò)向培養(yǎng)容器1內(nèi)注入培養(yǎng)液2，而將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3從培養(yǎng)容器1的內(nèi)面剝離。
[0071]根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法，可以不損傷培養(yǎng)容器1內(nèi)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3地容易并且高效地進(jìn)行剝離。
[0072][實(shí)施例]
[0073](實(shí)施例1)
[0074]進(jìn)行了利用上述第一實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法從培養(yǎng)袋1剝離粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的實(shí)驗(yàn)。
[0075]作為培養(yǎng)袋1，使用了聚乙烯(PE)制且尺寸為100mmX 225mm、膜厚為0.1mm的培養(yǎng)袋。在該培養(yǎng)袋1內(nèi)涂覆了纖連蛋白。
[0076]具體而言，將用PBS (磷酸緩沖生理鹽水)稀釋為5 μ g/ml的纖連蛋白溶液100ml以浸漬培養(yǎng)袋1的整個(gè)內(nèi)面的狀態(tài)在37°C的0)2培養(yǎng)箱內(nèi)保持約2小時(shí)。
[0077]然后，將纖連蛋白溶液全部排出后，用PBS清洗培養(yǎng)容器1的內(nèi)面1次(使100ml的PBS浸漬培養(yǎng)袋的整個(gè)內(nèi)面后立即排出)。液體的取放通過(guò)在設(shè)于培養(yǎng)袋1的口處連接注射器而進(jìn)行。
[0078]作為粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3，使用了 CH0細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巣)。另外，作為培養(yǎng)液2，使用了加入FBS (胎牛血清)10 %的DMEM培養(yǎng)基。將該CH0細(xì)胞200萬(wàn)個(gè)與培養(yǎng)液150ml —起接種在培養(yǎng)袋1內(nèi)，靜置培養(yǎng)72小時(shí)，使用所得的材料，進(jìn)行了剝離實(shí)驗(yàn)。
[0079]培養(yǎng)是利用0)2培養(yǎng)箱在37°C、CO 2濃度5%、濕度97%的條件下進(jìn)行。
[0080]剝離實(shí)驗(yàn)中，作為推壓構(gòu)件5，使用頭端為圓形的、粗1mm的針(頭端SR1)，作為裝載臺(tái)4使用了玻璃板。此后，用手指捏住該針向培養(yǎng)袋輕輕地推壓。此時(shí)的壓力為數(shù)十gf，將針按下至感覺(jué)到來(lái)自玻璃板的應(yīng)力為止。此后，使針離開(kāi)培養(yǎng)袋1。將其結(jié)果表示于圖5中。
[0081]圖5的⑴中，表示出用針推壓培養(yǎng)袋1的狀態(tài)的顯微鏡照片，圖5的⑵中，表示出使針離開(kāi)培養(yǎng)袋1的狀態(tài)的顯微鏡照片。根據(jù)圖5的(2)可知，僅在培養(yǎng)袋1的用針推壓了的區(qū)域中，粘附培養(yǎng)