涂層和涂覆方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于醫(yī)用植入物的涂層，其中所述涂層的至少一部分含有骨整合劑，并且該涂層的該相同和/或不同部分含有抗微生物金屬試劑。
【專利說明】
涂層和涂覆方法
[0001 ] 本申請是申請?zhí)枮?00980115900 · 8(國際申請?zhí)枮镻CT/US2009/035467)、申請日 為2009年2月27日、發(fā)明名稱為"涂層和涂覆方法"的中國專利申請的分案申請
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般涉及涂覆方法，更具體涉及用于礦化的身體部分的可植入假體的涂覆 方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 本領(lǐng)域已知在人體和動物體內(nèi)使用的醫(yī)用植入物用于很多目的（短期和長期的目 的）。與醫(yī)用植入物相關(guān)的一種常見并發(fā)癥是在植入部位的感染。植入物相關(guān)的感染通過很 多不同的手段加以處理，所述手段包括在植入手術(shù)之前和之后，在復位時期（set periods) 使用給予患者的預防性全身抗生素。然而，宿主部位(host site)的感染仍是常見的問題， 最經(jīng)常需要第二次手術(shù)來移除植入物。移除植入物的原因在于當出現(xiàn)感染時，植入物充當 入侵細菌優(yōu)選定居(colonize)的部位。當細菌菌群因此定居植入物時，它們極其耐受經(jīng)由 抗生藥物經(jīng)過全身方法(例如經(jīng)口或靜脈內(nèi)）的遞送而進行的根除。處理此類感染的唯一方 法是用另一植入物系統(tǒng)代替以移除被定居植入物的翻修手術(shù)(revision surgery)。翻修手 術(shù)與任何手術(shù)的所有并發(fā)癥相關(guān)，所述并發(fā)癥包括感染。另外，患者身體此刻不得不應(yīng)對兩 種手術(shù)的發(fā)病率。翻修手術(shù)的其它不合需要的方面包括失血和血栓形成。翻修手術(shù)還與更 大的植入失敗風險有關(guān)，并且翻修手術(shù)的醫(yī)學預后從不像初次手術(shù)那樣好。翻修手術(shù)比初 次手術(shù)更昂貴，并且患者需要額外的更長恢復時間來變得完全有功能，這可導致生產(chǎn)力損 失。如前述中可見，由于植入部位感染而進行的翻修手術(shù)對于患者是主要的醫(yī)療問題，并且 是治療費用的主要消耗。減少或消除植入物相關(guān)的感染的技術(shù)將對患者的健康以及輸送醫(yī) 療護理(delivering medical care)產(chǎn)生重要的積極貢獻。
[0004]醫(yī)學領(lǐng)域眾所周知，金屬銀及其化合物是良好的抗細菌劑。因此，銀及其化合物常 規(guī)用于治療淺表皮膚感染。通常對新生兒的眼部給予銀化合物以避免潛在的感染。銀化合 物相比傳統(tǒng)抗生素藥物的一個主要優(yōu)勢在于傳染性細菌對銀不形成抗性?？顾幖毦侵委?感染領(lǐng)域中的主要關(guān)注原因。因此銀化合物具有預防醫(yī)用植入物中的細菌感染的潛力，而 不存在發(fā)展抗性細菌菌株的風險。
[0005] 過去已經(jīng)進行了很多嘗試，以將金屬銀和/或其化合物并入醫(yī)用植入物的外表面 中。在下文總結(jié)這些嘗試及其局限性。
[0006] 可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法將銀鍍(涂覆）到醫(yī)用植入物上，包括電鍍、電沉 積以及用有機聚合物載體涂抹。其它涂覆技術(shù)包括化學氣相沉積(CVD)和物理蒸氣沉積 (PVD) XVD和PVD技術(shù)非常昂貴且需要高度精密復雜、受控的制造工藝。所有這些涂覆技術(shù) 在植入物中具有有限的應(yīng)用，因為生物界面，即，植入物與宿主組織之間的界面對于涂覆的 植入物相對于未經(jīng)涂覆的植入物而言是完全不同的。這種限制可對醫(yī)用植入物的成功具有 深遠的影響，通常將其生物界面設(shè)計用于與宿主組織整合（integration)。這種對植入物生 物界面要具有抗微生物性能，同時具有組織整合性能的需求形成本發(fā)明的重要方面，這將 在后文顯示。
[0007] 已經(jīng)進行嘗試以將銀離子"注入"到醫(yī)用植入物的表面上。該技術(shù)利用被撞擊在植 入物表面上的離子化銀的高能束(高速）。這種技術(shù)稱為"離子注入"。銀離子注入僅影響非 常薄的表面層(通常是納米范圍的厚度），因此有限用于長期有效的抗傳染藥劑。所"注入" 的銀離子可能如此充分地并入醫(yī)用植入物表面中，以致于極少的(銀離子)會浸出進入周圍 組織中用于有效殺死細菌。類似的局限性存在于稱為"離子束輔助沉積"（IBAD)的技術(shù)中。 離子注入技術(shù)也非常昂貴而且需要精密復雜、受控的制造工藝。
[0008] 先前討論了通常將植入物的生物界面(實際上是與宿主組織接觸的植入物表面） 設(shè)計為與宿主組織整合。醫(yī)用植入物中（尤其骨接觸矯形外科、脊柱和牙科植入物)使用的 常見表面工程技術(shù)是羥基磷灰石(HA)涂層。
[0009] 使用多種不同的方法將羥基磷灰石(HA)涂層施用于醫(yī)用植入物，所述方法包括等 離子噴涂法、電沉積法、溶液沉淀法和溶膠-凝膠法。也進行了將銀并入HA中的嘗試。主要 地，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)使用下述兩種不同方法來提供摻雜銀的涂層：
[0010] 一種將銀衍生物并入HA中的方法包括按序向植入物施加穩(wěn)定的氧化銀和HA粉末 層的步驟。然而，這種方法不形成均勻的摻雜銀的HA涂層。因此，覆蓋不均勻，并且在植入后 不能穩(wěn)定地保持離子釋放。即使在等離子噴涂之前使氧化銀與HA粉末混合，該氧化物也不 能與常規(guī)HA粉末進行化學反應(yīng)以及結(jié)合而形成均勻配制物。
[0011] 第二種方法是將具有羥基磷灰石涂層的植入物浸漬在硝酸銀溶液中大約24小時， 然后在空氣或惰性環(huán)境中干燥該植入物。這種方法依賴于將銀施加入已經(jīng)涂覆有HA的植入 物中。因此這種方法具有干擾現(xiàn)有HA涂層的物理和機械特性的可能性，從HA與基底醫(yī)用植 入物附著的觀點看，這可能是不合需要的。另外，這種技術(shù)不能使足夠的硝酸銀深深浸入HA 涂層中。醫(yī)用植入物上的HA涂層的厚度可以為數(shù)微米至好幾百微米。通過這種方法并入銀 需要硝酸銀與HA涂層之間的離子交換反應(yīng)。這種離子交換反應(yīng)僅發(fā)生在外表面，在那里HA 涂覆的植入物與硝酸銀溶液接觸。因此，盡管在表面處銀被并入遍布HA基質(zhì)，但是其未在HA 涂層的整個厚度被并入HA基質(zhì)中。因為銀僅在HA涂層的表面以及表面區(qū)域附近被并入(并 非遍及整個厚度），所以銀離子釋放到宿主組織中可能是短效的；也就是說，銀離子的釋放 將不會持續(xù)植入后數(shù)月避免感染所需的非常長的時期。此外，離子交換反應(yīng)要求小心控制 硝酸銀溶液的pH。硝酸銀溶液的理想pH可能不適合保存已經(jīng)涂覆在植入物上的HA結(jié)構(gòu)。在 此類方法中，如果沒有控制銀鹽溶液的PH，則附著于基底醫(yī)用植入物的HA涂層在浸漬過程 中可能受損(be compromised)。
[0012] 前述討論顯示了將銀及其化合物并入醫(yī)用植入物的生物界面中的現(xiàn)有技術(shù)方法 的局限性。對獲得醫(yī)用植入物的抗微生物涂層的商業(yè)可行的方法存在需要。具有抗微生物 性能的理想醫(yī)用植入物是這樣的：該醫(yī)用植入物的制造不背離目前實踐的制造方法，例如 等離子噴涂。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0013] 在本發(fā)明的一個實施方式中，提供適用于醫(yī)用植入物的涂層。此類植入物可具有 有益效果，例如它們能夠促進骨整合且/或同時減少或消除植入部位處的感染風險。
[0014] 根據(jù)一些實施方式，提供用于醫(yī)用植入物的涂層，其中所述涂層的至少一部分含 有骨整合劑(〇8此〇;[ 111：叩1>￡11：;[011叫0111 ：)，并且所述涂層的相同和/或不同部分含有抗微生 物金屬試劑（antimicrobial metal agent)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，醫(yī)用植入物具有與宿主生物環(huán)境接界（interfaces with)的涂層。此類涂層優(yōu)選包含促進骨整合或骨傳導性(osteoconductivity)的試劑，例 如鈣衍生物。如本文使用的術(shù)語"骨整合劑"指具有促進植入物與骨整合的能力的任何試 劑。術(shù)語"骨傳導性"指其中植入物能夠支持新的成骨細胞與骨原細胞附著的情況，這提供 了一種結(jié)構(gòu)，新細胞可迀移通過該結(jié)構(gòu)并且新血管可通過該結(jié)構(gòu)形成。
[0016] 應(yīng)理解，如貫穿本說明書所用的術(shù)語"鈣衍生物"用作可促進骨整合或骨傳導性的 試劑的代表性術(shù)語，并且常常稱作羥基磷灰石(HA)，但是其可以是任何合適的衍生物，其實 例是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分意識到的。一個實例是HA，但是諸如磷酸鈣、正磷酸鈣、磷酸三鈣、 陶瓷生物玻璃(ceramic bioglass)之類的其它衍生物都能發(fā)揮本發(fā)明的功能，并且非限定 性地并入本文。增強植入物整合入宿主組織中的其它形式的表面工程包括涂層磷灰石，例 如磷酸鈣、羥基磷灰石、磷酸三鈣、羥基磷灰石與磷酸三鈣的混合物、可再吸收性聚合 物、生物玻璃、衍生的基于的磷酸鹽化合物、正磷酸鹽、磷酸一鈣、磷酸八鈣、磷酸二鈣水合 物(透鈣磷石）、無水磷酸二鈣(三斜磷鈣石）、無水磷酸三鈣、磷鈣礦(whitlocktite)、磷酸 四鈣、無定形磷酸媽、氟磷灰石、氯磷灰石、非化學計量磷灰石（non-stoichiometrie apatites)、碳酸鹽磷灰石(carbonate apatites)、生物衍生的磷灰石、磷酸氫媽、磷灰石氫 鈣(calcium hydrogen apatite)、水不溶性陶瓷、磷酸鹽、多磷酸鹽、碳酸鹽、娃酸鹽、錯酸 鹽、硼酸鹽、沸石、膨潤土、高嶺土及其組合。將這些表面工程技術(shù)非限制性地并入本文。
[0017] 在一些實施方式中，鈣衍生物是羥基磷灰石和/或β-磷酸三鈣之一或組合。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過添加銀來改善天然鈣衍生物(例如HA)涂層的抗 細菌功效。
[0019] 銀可以作為銀取代的鈣衍生物(如HA)和/或離散的金屬銀顆粒中的一種或多種存 在。
[0020] 優(yōu)選地，抗微生物金屬試劑作為離散顆粒在所述涂層的至少一部分中存在?？刮?生物金屬可以包含銀、銅和/或鋅中的一種或多種。離散顆粒(例如銀顆粒)可優(yōu)選遍及整個 涂層厚度分布。
[0021] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選將金屬銀而不是離散的銀化合物(如氧化銀)并入醫(yī)用植 入物中。
[0022] 可以很多方式設(shè)計銀的使用（或其它抗微生物金屬種類，例如銅）。因為金屬抗微 生物劑要在宿主動物(包括人)組織中使用，因此其性能應(yīng)發(fā)揮下述非限定性重要功能： [0023] (a)抗微生物劑處理的醫(yī)用植入物應(yīng)抵抗細菌定居(bacterial colonization)。 在涂層中存在的銀的化學形式可對其產(chǎn)生影響。例如，銀可以作為化合物(如磷酸銀、氧化 銀、硝酸銀和其它化合物)存在于植入物表面上的涂層中。銀也可以以金屬銀形式存在。另 外，可以存在銀化合物和/或金屬銀的混合物。隨著抗微生物涂層在宿主組織環(huán)境中反應(yīng)， 確切的組成將影響植入物在植入時以及隨時間抵抗微生物定居的能力。
[0024] (b)抗微生物劑處理的醫(yī)用植入物應(yīng)將抗微生物金屬釋放到宿主組織中以實現(xiàn)其 抗微生物性能。可以作為銀離子或作為金屬銀或者作為銀的化合物(如磷酸銀或氧化銀)將 抗微生物金屬釋放到宿主組織中?？刮⑸飫┽尫诺幕瘜W性質(zhì)將取決于涂層的組成。應(yīng)理 解，可通過抗微生物涂層的組成來控制優(yōu)選的釋放類型(離子、金屬或化合物）。
[0025] (c)銀進入宿主環(huán)境中的釋放動力學可以是爆發(fā)釋放(彈丸(bolus))形式或長時 期持續(xù)(釋放)的形式或者爆發(fā)釋放與持續(xù)釋放的組合形式?？赏ㄟ^選擇涂層中的銀及其化 合物的化學性質(zhì)來設(shè)計釋放動力學和釋放持續(xù)時間，如上所討論。
[0026] (d)以上討論形式的銀釋放應(yīng)處于被宿主活組織、器官和有機體充分耐受的劑量。 該釋放不應(yīng)以可感覺的程度干擾植入物和涂層的其它生物學和機械功能。涂層和銀的釋放 應(yīng)是生物相容的，并且不應(yīng)對宿主環(huán)境呈現(xiàn)細胞毒素攻擊(cytotoxic challenge)。這可以 通過如上所列舉進行控制。
[0027] 存在于抗微生物涂層中的銀及其化合物的類型和濃度可通過多種方法來控制。可 通過與硝酸銀或本領(lǐng)域已知的其它銀化合物的離子交換反應(yīng)將銀并入涂層微粒(如HA)中。 在離子交換反應(yīng)之后，可將過量的銀化合物完全從HA粉末中沖洗出來，或者僅部分沖洗掉。 因此，HA粉末可不含未反應(yīng)的銀化合物或者可保留所有未反應(yīng)的過量銀化合物，或者可保 留部分量的未反應(yīng)銀。
[0028] 在一些實施方式中，離散的金屬顆粒(例如金屬銀顆粒)存在于包含骨整合劑的涂 層中，所述骨整合劑本身未被抗微生物金屬試劑取代。任選地，金屬顆粒分布在包含骨整合 劑的涂層中，所述骨整合劑也已經(jīng)被抗微生物金屬試劑取代。優(yōu)選地，金屬試劑是銀，且作 為取代進入骨整合劑中的銀（silver substituted into the osseointegration agent) 存在于涂層中。
[0029] 任選地，向醫(yī)用植入物提供涂層的一種方法是通過稱為"等離子噴涂"的技術(shù)。醫(yī) 用植入物上的等離子噴涂層的厚度通?？蓮募s1微米起，并且通常在10微米或數(shù)十微米至 數(shù)百微米的范圍內(nèi)。超過數(shù)千微米(1毫米或更大)的涂層厚度也是可能的。施加鈣衍生物涂 層到醫(yī)用植入物上的其它方法包括溶膠-凝膠法、電沉積、溶液沉淀和仿生涂層 (biomimetic coatings)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，用骨整合劑(例如鈣衍生物，如HA)的粉末對植入物 進行等離子噴涂。優(yōu)選地，在等離子噴涂之前，骨整合劑至少部分被抗微生物金屬試劑(例 如銀)取代。
[0031 ] 可以在常壓(atmospheric)條件下或在還原(reducing)條件下或在真空中施加等 離子噴涂層。另外，等離子噴涂設(shè)備可以處于受控的環(huán)境條件下。例如，所述環(huán)境可以含有 氬氣或其它惰性氣體?；蛘咚霏h(huán)境可以含有活性氣體。在其中操作等離子噴涂設(shè)備的環(huán) 境可決定被并入HA涂層中的銀(或其化合物）的類型。例如，在HA顆粒脫離等離子體(exit the plasma)并且在其被涂覆到植入物表面上之前，常壓(未受控制的環(huán)境)HA涂覆可導致 已經(jīng)存在于HA顆粒中的銀(及其化合物)通過離子交換反應(yīng)而氧化。真空等離子噴涂可改善 這種氧化反應(yīng)。如果想要特定的銀化合物，則可控制等離子噴涂設(shè)備的環(huán)境，以實現(xiàn)此類化 合物的制備。例如，如果希望用氟化銀作為HA涂層中的銀化合物，則可以通過本領(lǐng)域已知的 多種方法使環(huán)境富集氟。
[0032] 在一個實施方式中，不需要后處理熱處理（post-process heat treatment)來進 一步使涂層鞏固（consolidate)或使其與基底粘合(bond) 〇
[0033]如果要在本發(fā)明中使用等離子噴涂，則優(yōu)選地，至少一層含有抗微生物劑（如銀） 的涂層的等離子噴涂在還原環(huán)境中進行。
[0034]因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，提供用于醫(yī)用植入物的等離子噴涂層，其中所 述涂層的至少一部分含有骨整合劑，并且所述涂層的該相同和/或不同部分含有抗微生物 劑。
[0035]優(yōu)選地，骨整合劑是鈣衍生物。
[0036]優(yōu)選已經(jīng)在還原條件下對含有抗微生物劑的涂層的至少一部分進行等離子噴涂， 并且優(yōu)選在真空中進行等離子噴涂。
[0037]不希望受到理論的束縛，據(jù)信，當粉末(如HA)含有未反應(yīng)的銀化合物時，這些化合 物將在等離子體的高度還原環(huán)境(氫和惰性氣體混合物）中離解成金屬(元素)銀。因此，如 果在真空條件下進行等離子噴涂，則還原的金屬銀將作為離散的金屬顆粒連同HA和含銀的 HA-起被涂覆到醫(yī)用植入物上。另一方面，如果在常壓條件下進行等離子噴涂處理，則在等 離子體的還原氣氛中形成的金屬銀將與氧氣反應(yīng)而形成氧化物。然后將這些氧化物連同HA 和含銀的HA-起涂覆到醫(yī)用植入物上。從前述討論中可以理解，可通過將涂層施加到醫(yī)用 植入物上的工藝來控制醫(yī)用植入物上存在的銀的類型。
[0038] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述涂層的至少一部分含有抗微生物金屬的離散顆 粒。在一些實施方式中，所述抗微生物金屬包括金屬銀、銅和/或鋅中的一種或多種。
[0039] 優(yōu)選地，抗微生物金屬包括金屬銀。在一些實施方式中，金屬銀顆粒是球形或不規(guī) 則形狀。此外，金屬銀顆粒的直徑大小為約15nm至約1 Ομπι。
[0040] 在本發(fā)明的一些實施方式中，銀濃度足以具有抗細菌效果，例如具有約0.1至約 IOwt %的濃度。
[0041 ]在一些實施方式中，在含有鈣衍生物的所述涂層的所述至少一部分中所含有的所 述鈣衍生物是銀取代的，并且優(yōu)選銀取代的鈣衍生物具有遍及涂層厚度均勻分布的銀濃 度。銀取代的鈣衍生物可含有約〇. 1至約IOwt %的銀，優(yōu)選約0.5至約3. Owt %的銀。
[0042]在一些實施方式中，含有抗微生物劑的所述涂層的至少一部分具有遍及該涂層的 所述部分的整個厚度分布的抗微生物劑。
[0043]然后，在小心控制制造工藝的情況下，有可能產(chǎn)生等離子噴涂HA涂覆的醫(yī)用植入 物，該醫(yī)用植入物在HA涂層中含有下述類型銀中的任一種、或兩種或更多種的組合；
[0044] (1)銀可以從HA涂層的外表面直至固定深度存在，或者其可以存在于HA涂層的整 個厚度。
[0045] (2)銀可以是與HA完全反應(yīng)并遍及HA涂層均勻分布的銀化合物(例如磷酸銀、氧化 銀)的形式?；蛘?，銀化合物可以離散地分布到HA涂層的基質(zhì)中。
[0046] (3)銀可以完全并入天然HA晶體結(jié)構(gòu)中，作為銀改性的ΗΑ，并遍及HA涂層均勻分 布。
[0047] (4)銀可以是在等離子體的還原氣氛中形成的金屬銀的形式。這樣的銀作為離散 的銀顆粒分布在HA涂層的基質(zhì)中。金屬銀可以從HA涂層的外表面直至固定深度存在，或者 其可以存在于HA涂層的整個厚度。
[0048] 在本發(fā)明的一些實施方式中，涂層厚度優(yōu)選大于約Ιμπι，優(yōu)選約ΙΟμπι至約200μηι，最 優(yōu)選約30μηι至約100μπι。所述涂層優(yōu)選充分附著于基底材料(例如Ti6A14V、cp_Ti、CoCrMo、 Ta和其它生物醫(yī)學材料）并具有例如至少15Mpa的拉伸附著強度（tensile attachment strength)ο
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，天然鈣衍生物(例如HA)涂層的骨整合未受到銀添加 的損害。
[0050] 在本發(fā)明的一些實施方式中，涂層具有一種或多種骨傳導、骨促進和/或抗微生物 性能。
[0051 ]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，從含銀的鈣衍生物(例如HA)粉末的均勻配制物形成 涂層。在一些實施方式中，不需要將含銀的鈣衍生物粉末與其它含銀粉末共混，以將銀并入 涂層中。例如在一個實施方式中，不需要將HA粉末與其它粉末(例如氧化銀粉末)共混，以將 銀并入HA涂層中。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，骨整合劑(例如HA)粉末含有被吸附到表面上的至少 部分過量的銀反應(yīng)物。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，HA粉末含有銀取代物（silver substitution)和過 量的銀反應(yīng)物兩者。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，用于取代進入骨整合劑(例如HA)粉末中的銀反應(yīng)物 是一種或多種銀鹽，如硝酸銀(AgNO3)和/或氟化銀(AgF)。或者，或另外，銀反應(yīng)物可以是一 種或多種鹵化銀，如碘化銀。
[0055]在本發(fā)明的一些實施方式中，除銀之外，鈣衍生物還被下述物質(zhì)中的一種或多種 取代:碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅和/或鋅。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過首先將常規(guī)HA粉末在含硝酸銀和/或含氟化銀 的水溶液或有機溶液中浸漬一段時間來形成含銀的鈣衍生物(例如HA)粉末。在一些實施方 式中，水溶液或有機溶液可包含氟化銀和硝酸銀兩者。
[0057]優(yōu)選地，鈣衍生物（例如HA)粉末在溶液中浸漬并攪拌合適的時間，以允許在HA粉 末與Ag鹽(一種或多種)溶液之間發(fā)生充分的離子交換反應(yīng)。這樣的時期可以為數(shù)小時（例 如10小時）至一周，例如約一天至三天的時期。反應(yīng)更優(yōu)選為大約兩天。對于最佳結(jié)果而言， 避免使混合物過度暴露于光下可能是必要的。
[0058]可以在室溫下浸漬骨整合劑(例如HA)粉末，然而，優(yōu)選稍微更溫熱的溫度，以便增 加溶液進入HA中的溶解度。不應(yīng)升高溫度太多，以免分解該組合物。
[0059]在其中HA粉末與Ag鹽于水溶液或有機溶液中反應(yīng)的期間，維持所述溶液的適當pH 水平通常也是重要的。通常應(yīng)將pH保持在這樣的水平，以使HA溶解達到最低，但同時減少硝 酸銀與OH反應(yīng)并沉淀而形成氫氧化銀，并最終變成氧化銀的可能性?？蓪H水平保持在 6.5-8.5的范圍內(nèi)，但是其優(yōu)選高于6.7，以防止HA溶解。更優(yōu)選地，混合物的pH水平在6.8-7.2的范圍內(nèi)，但是其它水平也是可以接受的。
[0060] 在離子交換反應(yīng)之后，可放置混合物至風干，或可以用去離子蒸餾水(DDH2O)沖洗 和/或洗滌，然后使其風干。
[0061] 在本發(fā)明的一些實施方式中，提供制備抗微生物涂層的方法，其中通過離子交換 或溶膠-凝膠方法制備含銀的鈣衍生物粉末，并隨后將其等離子噴涂到基底材料上。
[0062] 在一些實施方式中，通過以下方式制備含銀的鈣衍生物粉末：
[0063] a.將鈣衍生物粉末懸浮在銀鹽溶液中，持續(xù)足以將鈣離子交換為銀離子的時間和 溫度，和
[0064] b.將所述經(jīng)過離子交換和洗滌的鈣衍生物干燥。
[0065] 在一些實施方式中，在步驟(a)與(b)之間進行洗滌所述離子交換的鈣衍生物粉末 的額外步驟。
[0066]在一些實施方式中，鈣衍生物粉末與銀鹽溶液之間的離子交換反應(yīng)在約20°C至95 °(：的溫度下進行約24至168小時。在一些實施方式中，銀鹽溶液是濃度為HT2-KT4 M的硝酸 銀或氟化銀，并且硝酸銀與HA粉末的質(zhì)量比在0.01-0.1的范圍內(nèi)。
[0067] 此外，在一些實施方式中，通過下述的溶膠-凝膠法制備含銀的鈣衍生物粉末：
[0068] (a)將鈣、銀和/或磷前體的組合物混合，以獲得均勻的溶膠-凝膠溶液；
[0069] (b)在20_95°C的溫度下，將該溶膠-凝膠溶液老化，持續(xù)合適的時期；
[0070] (c)在高于室溫的溫度下將該溶膠-凝膠溶液干燥并煅燒，持續(xù)合適的時期；
[0071] (d)將經(jīng)過煅燒的粉末處理成所需的粒度分布，用于隨后的等離子噴涂處理。
[0072] 在一些實施方式中，鈣前體是硝酸鈣。在一些實施方式中，銀前體是硝酸銀。在一 些實施方式中，磷前體是磷酸二氫銨。在一些實施方式中，銀前體的濃度范圍是約〇 . Iwt % 至1(^1:%，優(yōu)選0.5￥1:%至3.(^1:%。
[0073] 在某些實施方式中，將氟和碳酸鹽前體與鈣、銀和磷前體混合，以獲得均勻的溶 膠-凝膠溶液。在一些實施方式中，氟前體是氟化銨。在一些實施方式中，碳酸鹽前體是碳酸 銨。在一些實施方式中，F(xiàn)和/或碳酸鹽前體的濃度是約10- 2-10-3Μ。
[0074] 在某些實施方式中，將碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅或鋅前體或者其組合 與鈣、銀和磷前體混合，以獲得均勻的溶膠-凝膠溶液。
[0075] 其余的固體混合物包含其中含有銀和/或氟化物的均勻的HA粉末配制物。該均勻 的HA粉末配制物可以被碾碎(ground up)或可以不被碾碎，然后用于常規(guī)的等離子噴涂處 理中，以便像一般的HA粉末一樣涂覆生物醫(yī)用植入物或醫(yī)療器械。本發(fā)明的浸漬和碾磨過 程通常僅微不足道地增加 HA粉末的平均粒度，并因此不干擾可取決于常規(guī)設(shè)備的后續(xù)等離 子噴涂處理。
[0076] 在一些實施方式中，在噴涂之前，含銀的鈣衍生物粉末配制物的大小分布與天然 純鈣衍生物粉末基本相同。
[0077] 使用前述風干方法而不沖洗的一種可能的優(yōu)勢在于，通過不進行沖洗，在水溶液/ 有機溶液蒸發(fā)后，除了均勻的HA/銀粉末配制物之外，可能存在少量過量的硝酸銀或氟化 銀。這可確保在等離子噴涂工藝過程中存在的極高溫度之后，即使均勻HA粉末中的一些銀 蒸發(fā)，也有一些殘留的（即，"額外的"）銀存在于涂層中?？梢岳貌煌你y鹽濃度來調(diào)整最 終的等離子噴涂層中的銀含量和降解曲線(degradation profile)。
[0078] 在本發(fā)明的一個實施方式中，提供治療需要手術(shù)植入物的患者的方法，所述方法 包括對所述患者進行手術(shù)，將包含權(quán)利要求1至20中任一項所述的涂層的醫(yī)用植入物插入 所述手術(shù)部位中，以及在手術(shù)后將所述植入物留在原位置，其中所述植入物降低了植入物 部位處的術(shù)后感染的風險或消除植入物部位處的術(shù)后感染。
[0079] 如本文所用的術(shù)語"銀"可包含基本純的銀、具有基于銀的組分的組合物、具有基 于銀的組分的前體、銀化合物或具有銀的合金。根據(jù)前述討論，可能的是，可以表面同時發(fā) 揮抗微生物功能的方式將銀和/或銀化合物并入醫(yī)用植入物的生物界面(如HA涂層）。
[0080] 其它金屬種類也已知具有類似的抗微生物效果。這些包括但不限于銅、鋅、汞、鉛 和其它金屬。這些金屬種類具有寬范圍的有效性，這取決于所遞送的劑量。另外，這些金屬 種類中的一些可能對宿主組織具有毒性，這也取決于所用的劑量以及其中施用它們的組織 部位。盡管本發(fā)明涉及作為優(yōu)選的抗微生物金屬種類的銀，但是其不僅限于銀。也可以使用 不同金屬種類的混合物。例如，可以使用變化量的銀和銅化合物。
[0081] 本發(fā)明適用的其它方面從下文提供的詳述中將變得顯而易見。應(yīng)理解，詳述和特 定實例，在表示本發(fā)明的【具體實施方式】的同時，意圖僅用于闡述的目的，而并非意圖限定本 發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0082] 被并入并形成本說明書的一部分的附圖圖解了本發(fā)明的實施方式并連同所撰寫 的說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理、特性和特征。在附圖中：
[0083] 圖1是骱(&)、八8-骱-以13)、厶8-骱-]\1(。）和厶8-骱-!1((1)-涂覆的1^6厶14￥圓盤（(^8。） 的掃描電子顯微鏡照片。
[0084]圖2是HA(左側(cè)）和Ag-HA-H(右側(cè))-涂覆的Ti6A14V圓盤的橫截面視圖的掃描電子 顯微鏡照片。在遍及Ag-HA-H樣品的涂層的不同位置測量銀濃度，如通過"X"標記所示。 [0085]圖3顯示不同的涂覆試樣(coupon)的拉伸粘合強度。
[0086] 圖4顯示HA-涂覆的和Ag-HA-H-涂覆的樣品（sample)的斷面。
[0087] 圖5顯示樣品在PBS中的銀釋放曲線(release prof ile)。
[0088]圖6a(HA)、6b(Ag_HAl)和6c(Ag_HA2)顯不每種不同樣品在低放大倍數(shù)下的二次電 子圖像，提供了每種樣品類型的概觀。
[0089]圖7&(說）、713以8-說1)和7(3(48-說2)顯示圖6樣品的表面形態(tài)的較高放大倍數(shù)下 的二次電子圖像。
[0090]圖8a(HA)、8b(Ag-HAl)和8c(Ag-HA2)顯不在低放大倍數(shù)下不同樣品的背散射電子 圖像，提供了每種樣品類型的概觀。
[0091] 圖9a(HA)、9b(Ag-HAl)和9c(Ag-HA2)顯示來自圖8中的每種樣品的較高放大倍數(shù) 下的背散射圖像。
[0092] 圖 IOa(Ag-HAl)和 10b(Ag_HA2)以及11&(六8-說1)和1113(六8-骱2)顯示對圖8和9的 樣品的較高放大倍數(shù)檢查。
[0093]圖12是本發(fā)明樣品的背散射EM。
[0094I圖13a顯示通過EDX微量分析獲得的元素點圖（dot-map)，而樣品Ag-HA2的相應(yīng)區(qū) 域的背散射圖像示于圖13b中。
[0095]圖 14a (Ag-HA 1)和 14b (Ag-HA2)顯示來自 Ag-HA 1 樣品和Ag-HA2樣品的 EDS 光譜。 [0096]圖15顯示HA2樣品上的離散的明亮顆粒的EDX譜(在圖像中用〃x〃標記的點）。
[0097]圖16a_c是遠離離散的明亮顆粒的涂層區(qū)域的圖像，所述區(qū)域也在HA2樣品上通過 EDXA進行評價。
[0098] 圖17顯示三種樣品HA、Ag-HAl和Ag-HA2的X-射線衍射圖。
[0099] 圖18顯示三種不同樣品的拉伸粘合強度（tensile bonding strength)。
[0100] 圖19是本發(fā)明涂層的實施方式的示意圖。
[0101 ]圖20是含銀的改性β-TCP和布比卡因的頂層PLGA涂層的低倍放大。
[0102] 圖21是含銀的改性β-TCP和布比卡因的頂層PLGA涂層的高倍放大。
[0103] 圖22是本發(fā)明另一實施方式的示意圖。
[0104] 圖23是PLGA涂層上的PLGA珠的頂視圖的低倍放大。
[0105]圖24是PLGA涂層上的PLGA珠的頂視圖的高倍放大。
[0106]圖25是PLGA涂層的高倍放大。
[0107] 圖26(a)和（b)是來自9-天拔出（9-day pulled out)植入物的SEM圖像：來自 Rabb i t#l A的低Ag-改性的磷酸|丐_涂覆的植入物。
[0108] 圖27(a)和(b)是來自9-天拔出植入物的SEM圖像:來自Rabbit#lA的無磷酸鈣-涂 覆的植入物。
[0109] 圖28(a)和(b)是來自9-天拔出植入物的SEM圖像:來自Rabbit#lB的高Ag-改性的 磷酸鈣-涂覆的植入物。
[0110]圖29(a)和(b)是來自9-天拔出植入物的SEM圖像:來自Rabbit#lB的無磷酸鈣-涂 覆的植入物。
[0111] 圖30是'低S-CPd天的背散射SEM。（樣品4A右側(cè)（sample 4A right))。多孔涂層 區(qū)域內(nèi)的礦化組織(骨）（箭頭）的小區(qū)域。虛線顯示定點鉆孔(site drilling)之后宿主骨 的位置。
[0112] 圖31是'高S-CPJ天的背散射SEM。（樣品5B左側(cè)(sample 5B left))。多孔涂層區(qū) 域內(nèi)的礦化組織(骨）（箭頭)的小區(qū)域。虛線顯示定點鉆孔之后宿主骨的位置。
[0113] 圖32是'對照1無 CP)，9天的背散射SEM。（樣品5B右側(cè)）。多孔涂層區(qū)域內(nèi)的礦化組 織(骨）（箭頭)的小區(qū)域。
[0114] 圖33是'低S-CPde天的背散射SEM。（樣品9C右側(cè)）。遍及整個多孔涂層深度的廣 泛的骨向內(nèi)生長。虛線表示最初鉆孔骨的邊界。
[0115] 圖34是'高S-CPde天的背散射SEM。（樣品8D右側(cè)）。遍及整個多孔涂層深度的廣 泛的骨向內(nèi)生長。虛線表示可能的最初鉆孔骨的邊界。
[0116] 圖35是'對照無 CP)，16天的背散射SEM。（樣品2C左側(cè)）。遍及多孔涂層深度的骨 向內(nèi)生長;難以鑒定最初鉆孔骨的邊界。
[0117] 圖36(a)和(b)顯示9-天燒結(jié)的多孔涂覆的Ti6A14r對照'植入物-(a)和(b)樣品 5B右側(cè)-藍綠色染色區(qū)域是骨（舊的以及新形成的）。由于切片厚度，一些骨未顯示染色效應(yīng) 并且呈現(xiàn)灰色。在一些區(qū)域中在界面附近存在少量的纖維組織(箭頭）。
[0118] 圖37(a)和(b)顯示具有'低'S-CP覆蓋層(over-layer)的9-天燒結(jié)的多孔涂覆的 H6A14V植入物-(a)樣品8A左側(cè)，（b)樣品4A右側(cè)-在(b)中，由于鉆孔（以及可能由于一些骨 枯萎(bone die-back))引起的最初骨丟失的程度通過截斷的(骨)小梁是明顯的。
[0119] 圖38(a)和(b)顯示具有'高4-CP覆蓋層的9-天燒結(jié)的多孔涂覆的Ti6A14V植入 物_(a)&(b)樣品8B左側(cè)-高放大倍數(shù)及低放大倍數(shù)圖像都顯示由于定點制備(鉆孔）以及可 能由于隨后的骨枯萎引起的骨丟失的程度（（b)中的虛線）。然而，獲得合適的壓配合，這使 得在界面區(qū)內(nèi)的早期骨形成得以發(fā)生并且進入多孔涂層中（箭頭）。
[0120]圖39(a)和(b)顯示16-天燒結(jié)的多孔涂覆T16A14V植入物'對照1 直入物_(a)&(b) 樣品2C左側(cè)-遍及多孔涂層(藍綠色染色區(qū)域)的廣泛的新骨形成和向內(nèi)生長。
[0121]圖40(a)和(b)顯示具有HfS-CP覆蓋層的16-天燒結(jié)的多孔涂覆Ti6A14V植入物- (a)&(b)樣品9C右側(cè)-廣泛的新骨形成和向內(nèi)生長。[(a)中所見的包埋人工制品（空氣泡）的 樣品]。
[0122] 圖41(a)和(b)顯示具有'高'S-CP覆蓋層的16-天燒結(jié)的多孔涂覆H6A14V植入物-(a)&(b)樣品8D右側(cè)-沿著植入物長度的良好的骨向內(nèi)生長。
[0123] 圖42和43顯示微生物活性的聲處理計數(shù)結(jié)果。
[0124] 圖44和45顯示微生物活性的懸浮液計數(shù)(suspension counts)結(jié)果。
[0125] 圖46顯示Ag/HA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MC3T3細胞在A450nm-A655nm處的平均吸光度。誤 差條代表數(shù)據(jù)的標準偏差。
【具體實施方式】
[0126] 所述實施方式的下述描述在性質(zhì)上僅僅是示例性的，并且決非有意限制本發(fā)明、 其應(yīng)用或用途。
[0127] 通過首先將常規(guī)羥基磷灰石(HA)粉末（如商業(yè)可得的平均粒度為約45至約125微 米的HA粉末)浸漬在含硝酸銀和/或含氟化銀的水溶液或有機溶液中一段時間來形成抗微 生物HA粉末配制物。在一些實施方式中，水溶液或有機溶液可包含氟化銀和硝酸銀兩者。在 一些實施方式中，可以使用β-磷酸三鈣，或者可以使HA與β-磷酸三鈣結(jié)合。磷酸鈣混合物包 括約〇.1?1:%至約1〇￥1:%、約0.1￥1:%至約7￥1:%或約0.1￥1:%至約5￥1:%的銀。在一個特定實 施方式中，磷酸1丐混合物包括約〇. 5wt %至約30wt %或約0.5wt %至約2wt %的銀。
[0128] 術(shù)語〃wt%〃或〃重量百分比〃指涂層或涂層內(nèi)的層的重量百分比，并且其不包括植 入物本身的重量。
[0129] 在一些實施方式中，可將碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅和鋅中的一種或多 種添加至磷酸鈣混合物中。
[0130] HA粉末在溶液中浸漬和攪拌約1天至約7天的時期。優(yōu)選地，HA粉末在溶液中浸漬 和攪拌約1天至3天的時期，以允許在HA粉末與Ag鹽(一種或多種)溶液之間進行充分的離子 交換反應(yīng)。反應(yīng)更優(yōu)選為約2天。此外，對于最佳結(jié)果而言，使混合物避免過度暴露于光下可 能是必要的。
[0131] 可以在室溫下浸漬HA粉末，但是優(yōu)選稍微更溫熱的溫度，以便增加溶液進入HA中 的溶解度。不應(yīng)升高溫度太多，以免分解該組合物。在一些實施方式中，可以使用約20°C至 約95°C的溫度范圍。在其它實施方式中，可以使用約60°C至約80°C的溫度范圍。
[0132] 在其中HA粉末與Ag鹽于水溶液或有機溶液中反應(yīng)的期間，維持所述溶液的適當pH 水平通常也是重要的。通常應(yīng)將pH保持在這樣的水平，以使HA溶解達到最低，但同時減少硝 酸銀與OH反應(yīng)并沉淀而形成氫氧化銀，并最終變成氧化銀的可能性?？蓪H水平保持在 6.5-8.5的范圍內(nèi)，但是其優(yōu)選高于6.7，以防止HA溶解。更優(yōu)選地，混合物的pH水平在6.8-7.2的范圍內(nèi)，但是其它水平也是可以接受的。
[0133] 在離子交換反應(yīng)之后，可放置混合物至風干，或可以用去離子蒸餾水(DDH2O)沖洗 和/或洗滌，然后使其風干。
[0134] 其余的固體混合物包含其中含銀和/或氟化物的均勻的HA粉末配制物。該均勻的 HA粉末配制物可以被碾碎，然后用于常規(guī)的等離子噴涂處理中，以便像一般的HA粉末一樣 涂覆生物醫(yī)用植入物或醫(yī)療器械。本發(fā)明的浸漬過程通常僅微不足道地增加 HA粉末的平均 粒度，并因此不干擾可取決于常規(guī)設(shè)備的后續(xù)等離子噴涂處理。
[0135] 在第一種方法中，將HA粉末與AgF溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。干燥混合 物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。作為實例，氟化銀可以具有約I X KT2至約 I X KT4M的濃度。作為實例，氟化銀與HA粉末的質(zhì)量比在約0.01至約0.1的范圍內(nèi)。在一個實 施方式中，將混合物在空氣中于約50°C至約95°C的溫度下干燥約一天至約三天。在又一實 施方式中，銀溶液的濃度為I X HT3至約I X 10、。
[0136] 在第二種方法中，將HA粉末與AgNO3溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。干燥混 合物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。作為實例，硝酸銀可以具有約IX KT2至 約I X KT4M的濃度。作為實例，硝酸銀與HA粉末的質(zhì)量比在約0.01至約0.1的范圍內(nèi)。在一個 實施方式中，將混合物在空氣中于約50°C至約95°C的溫度下干燥約一天至約三天。
[0137] 在第三種方法中，將HA粉末與AgF和AgNO3溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。干 燥混合物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。
[0138] 在第四種方法中，將HA粉末與AgF溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。沖洗混合 物。然后干燥混合物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。
[0139] 在第五種方法中，將HA粉末與AgNO3溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。沖洗混 合物。然后干燥混合物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。
[0140] 在第六種方法中，將HA粉末與AgF和AgNO3溶液混合。浸漬并攪拌混合物1至3天。沖 洗混合物。然后干燥混合物?？蓪⑺门渲莆锏入x子噴涂到醫(yī)用植入物上。
[0141] 在一些實施方式中，通過下述的溶膠-凝膠法制備含銀的HA粉末：（a)將鈣、銀和/ 或磷前體混合，以得到均勻的溶膠-凝膠溶液；（b)在約20°C至約95°C的溫度下老化該溶膠-凝膠溶液約7至約9天；（c)在約500至約800°C的高溫下干燥并煅燒該溶膠-凝膠溶液約2至 約4小時;和(d)碾磨并篩分上述煅燒粉末至所需的粒度分布，用于后續(xù)的等離子噴涂處理。 在一些實施方式中，平均粒度是約45至約150微米。作為實例，鈣前體可以是硝酸鈣，銀前體 可以是硝酸銀，而磷前體可以是磷酸二氫銨。銀前體濃度可以在約0.1重量百分比至約10重 量百分比、約0.1 wt%至約7wt%或約0.1 wt%至約5wt%的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約0.5重量百分 比至約3重量百分比，或約0.5wt%至約2wt%。
[0142] 在一些實施方式中，在施加磷酸媽涂層之前，可將底層（base layer)或底漆層 (primer layer)施加于基底。底層可用來避免或減少基底與涂層之間的反應(yīng)?；蛘撸讓涌?以改進涂層-基底界面處的拉伸粘合強度。可利用真空等離子噴涂工藝施加底層?；蛘?，可 以利用常壓等離子噴涂、離子濺射法（ion sputtering)、溶膠-凝膠浸涂法、溶液沉淀、仿生 法(biomimetic method)或電沉積來施加底層。底層可以是多種化合物。作為實例，底層可 以是金屬涂層、陶瓷涂層或可生物降解的生物陶瓷涂層。尤其，底層可包括磷酸鈣、生物玻 璃、多磷酸鈣、磷酸四鈣(TTCP)、β-磷酸三鈣(TCP)、β-焦磷酸鈣(CPP)、β-偏磷酸鈣(CMP)或 基本純的ΗΑ。在一個特定實施方式中，底層厚度為約1至約50微米，更優(yōu)選為約10至約20微 米。在一個【具體實施方式】中，底層和抗微生物涂層的總厚度為約30至約300微米，更優(yōu)選為 約50至約100微米。
[0143] 在一些實施方式中，氟和碳酸鹽前體可以與鈣、銀和磷前體混合，以得到均勻的溶 膠-凝膠溶液。作為實例，氟前體可以是氟化銨，碳酸鹽前體可以是碳酸銨。氟前體濃度可以 在約HT 2至約KT3M的范圍內(nèi)。碳酸鹽前體濃度可以在約0.1至約KT3M的范圍內(nèi)。
[0144] 在一些實施方式中，使骨刺激材料與鈣、銀和磷前體混合，以得到均勻的溶膠-凝 膠溶液。作為實例，鹽、礦物質(zhì)、金屬、金屬氧化物、碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅或鋅 前體或其組合可以與鈣、銀和磷前體混合，以得到均勻的溶膠-凝膠溶液。
[0145] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易意識到，溶液中的硝酸銀和/或氟化銀的確切的量或 濃度可以變化。僅有小部分的硝酸銀和/或氟化銀可以被吸收進入HA粉末中，因此，可使溶 液的濃度最優(yōu)化，以減少硝酸銀或氟化物浪費?；蛘撸蓪㈩~外的氟化銀和/或硝酸銀添加 至溶液中，以補償在等離子噴涂期間銀和/或氟的一些蒸發(fā)/汽化。
[0146] 另外，鍶和/或釩可以單獨使用，或者與本發(fā)明的銀和/或氟化物以及其它金屬(如 銅和鋅)組合使用。
[0147] 通過將少量的銀和/或氟化物添加至常規(guī)的HA粉末中，本發(fā)明為生物醫(yī)用植入物 提供改進的抗微生物/抗感染/骨整合性能。此外，現(xiàn)有技術(shù)不能提供能夠如本發(fā)明那樣被 等離子噴涂的均勻的HA粉末配制物。相比于單獨非均勻施加的銀和HA，在等離子噴涂之后， 本發(fā)明的均勻的HA/銀粉末配制物可提供均勻得多且受控的降解涂層。
[0148] 盡管以上實例包括羥基磷灰石，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，可以使用其它 形式的磷酸鈣。作為實例，磷灰石、非化學計量磷灰石、磷酸鈣、正磷酸鹽、磷酸一鈣、磷酸二 鈣、磷酸三鈣、磷鈣礦、磷酸四鈣、無定形磷酸鈣可以代替HA。
[0149] 本發(fā)明還提供各種醫(yī)用植入物，優(yōu)選使用如本文所述的任意方法和技術(shù)進行涂 覆。醫(yī)用植入物的涂層可以包含一個或多個層，其中每一層可以包含與另一層相同或不同 的組成。優(yōu)選在還原環(huán)境(例如在真空中）中等離子噴涂每一層。
[0150] 任選地，醫(yī)用植入物具有包含很多層的涂層，并且其中抗微生物劑的濃度在至少 兩個涂層層中是不同的。
[0151]優(yōu)選制造本發(fā)明的植入物，以增加成功整合到宿主環(huán)境中的機會，同時提供抗微 生物環(huán)境以降低感染風險或預防感染。
[0152] 因為參考相應(yīng)的說明可以對上述示例性實施方式進行各種修改，而不背離本發(fā)明 的范圍，所以意圖包含在前述描述以及示于附圖中的所有內(nèi)容應(yīng)解釋為闡述性的而非限制 性的。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)被任意上述示例性實施方式所限制，而應(yīng)僅根據(jù)所附 權(quán)利要求以及它們的等價物進行定義。
[0153] 實施例
[0154] 實施例1 [0155] 方法
[0156]在去離子蒸餾水(DDH2O)中制備三種不同濃度的硝酸銀溶液，用于硝酸銀溶液與 HA粉末之間的離子交換反應(yīng)。一些來自硝酸銀溶液的Ag離子將取代來自HA結(jié)構(gòu)的Ca離子， 同時，一些銀化合物將被物理吸附到HA表面上。HA粉末中的目標銀含量分別是0.3wt%、 lwt%和3wt%。硝酸銀和HA粉末的質(zhì)量列在表1中。
[0157]表1用于離子交換反應(yīng)的硝酸銀和HA粉末的質(zhì)量
[0159] 首先將硝酸銀（BDH，Cat.#BDH0276-125G)溶解在容納于3升玻璃燒杯中的DDH 2O 中，然后按照表1將HA粉末（MED丨PURE 'MEDICOAT AG，粒度:-125μπι+45μπι)添加至所制 備的硝酸銀溶液中。將HA和硝酸銀溶液在180RPM下于定軌搖床中在室溫下攪拌3天，以允許 發(fā)生均勻的離子交換反應(yīng)。
[0160] 在離子交換反應(yīng)之后，使溶液置于烘箱中在80°C下干燥，以蒸發(fā)水。然后將干燥且 改性的HA粉末手動使用研杵和研缽輕微研磨，以使干燥過程中形成的附聚物破碎。然后將 磨碎的改性HA粉末通過100-325目篩(W. S.TyIer，Inc .，USA)篩分。丟棄任何大于150μηι或小 于45μπι的HA粉末。在100-325目篩之間收集至少98%的HA粉末。
[0161] 使用激光衍射粒度分析儀(Laser Diffraction Particle Size Analyzer)(型號 LS13 320，Beckman Coulter，USA)進一步表征銀改性的HA粉末。所有測量列在表2中。隨著 HA粉末中銀含量的增加，平均粒度輕微增加。低和中等銀HA粉末的粒度分布與對照的純HA 粉末相似。
[0162] 表2純HA和改性HA粉末的粒度和大小分布
LUi〇4」 不I」用A-坍線衍坍UKU;米衣佌籾木的結(jié)佝、TO狃肷和瞄權(quán)入/JHTO喂徐';。仕H&M Analytical Services，Inc · (Allentown，NJ，USA)進行該分析。將涂覆樣品置于標準樣品支 架上，并使用Cu輻射在40kV/30mA下送入Phi I ips PW3020衍射計中。在10°至70°的范圍內(nèi)進 行掃描，其中步長為〇.〇2°，且每個樣品的計數(shù)時間為8小時。使用與能量分散X-射線分析 (JEOL JSM-6460LV，日本)結(jié)合的掃描電子顯微鏡檢術(shù)來檢查涂層的表面形態(tài)、Ca/P比率、 銀含量以及涂層厚度。
[0165] 通過將粉末(預噴涂)完全溶解在10%硝酸溶液中進一步分析銀改性粉末的組成。 從硝酸溶液中取出等分試樣，利用電感耦合等離子體(ICP)質(zhì)譜進行銀離子濃度分析。
[0166] 然后在Medicoat( MSgenwil，瑞士)將這些銀改性HA粉末用于常規(guī)真空等離子噴 涂工藝中，用于含銀HA涂層。其上被噴涂粉末的所有基底由研磨-退火的(mill-annealed) Ti6A14V合金制備。平面圓盤樣品的直徑為12.6mm，厚度為3.1mm。在等離子噴涂之前對這些 試樣進行噴砂處理并清潔。對于純HA粉末和銀改性HA粉末兩者的所有噴涂參數(shù)都相同。具 有Φ12.6_孔的不銹鋼板用于安裝Ti6A14V試樣。在涂覆處理之后，所噴涂的涂層用異丙醇 沖洗。
[0167] 按用于粉末的相同方式，利用X-射線衍射(XRD)來表征涂層的結(jié)構(gòu)、相組成和晶粒 大小。
[0168] 使用來自四組中每一組的三個1英寸直徑的Ti6A14V試樣作為沉積HA涂層或摻雜 Ag的HA涂層的基底，按與ASTM F1147中所述方式類似的方式評價涂層的拉伸附著強度。
[0169]每個試樣的背面和測試粧(testing stub)的端部均用80-砂紙輕微打磨，以增強 環(huán)氧附著強度。用丙酮清潔試樣的背面(即，未涂覆的表面），并使其風干2-3分鐘。
[0170]在背表面上使用一層FM1000粘合劑以及在涂覆表面上使用一層FM1000粘合劑，使 拉伸測試粧粘著至每個試樣的相反表面。這通過以下方式來完成:將該結(jié)構(gòu)裝配在固化夾 具(curing fixture)中，并在2.31bf (ION)的靜重載荷下，338°F( 170°C)的溫度下，將該夾 具在對流傳熱爐中放置130分鐘（或者，如果兩個夾具同時放在爐中則為135分鐘），以熱固 化該膠。在從爐中移出夾具并使其冷卻至室溫之后，去除靜重，并從夾具中取出該結(jié)構(gòu)。 [0171 ]通過使每種結(jié)構(gòu)在0 · 10in/min(2 · 5mm/min)的移位速度(displacement rate)下 經(jīng)歷拉伸載荷直到破壞，來測試每種結(jié)構(gòu)。記錄每種結(jié)構(gòu)的高峰載荷和破壞方式。通過用高 峰載荷除以試樣的橫截面積來測定拉伸附著強度。測試之后，檢查每個試樣，以確保膠沒有 滲透入基底，膠滲透入基底表示無效的試驗。
[0172] 對每種條件使用一種樣品，用于評價銀從涂層的釋放。將涂覆的圓盤樣品于37°C， 在2mL I3BS (pH = 7.4)中浸漬24、72和168小時。在每個時間點，取出ImL溶液，并在電感耦合 等離子體（ICP)銀分析之前，在4°C冰箱存于eppendorf試管中，在Environmental Testing&Consulting，Inc ?]^11^|11丨8，11'1進行所述電感親合等離子體銀分析。將15以1^濃硝酸 添加到試管中，以防止銀從溶液中沉積。
[0173] 結(jié)果
[0174] 銀改性的HA粉末的XRD和ICP結(jié)果列在下表3中?？侫g(XRD)是來自粉末XRD相組成 分析的結(jié)果。XRD結(jié)果表明，銀作為金屬銀、硝酸銀（即，含銀的初始銀離子交換反應(yīng)介質(zhì))或 氧化銀存在。應(yīng)注意，XRD僅測定金屬銀或銀化合物的晶相。其不檢測已經(jīng)被取代進入HA晶 體中的銀。ICP用于測定銀改性HA粉末中的銀的總量。ICP分析測量存在的所有銀-作為在HA 晶體中取代的(銀)而存在的銀以及與HA晶體分離的，作為離散化合物(例如硝酸銀、氧化銀 和金屬銀）而存在的銀。包含在HA晶體中的銀的量可以通過從ICP結(jié)果減去XRD來測定。例 如，對于Iwt % Ag-HA粉末，XRD結(jié)果顯示在銀改性的HA粉末中存在0.45wt %的銀;然而，同樣 粉末的ICP結(jié)果顯示在該改性粉末中的總Ag含量是0.98wt%，這接近設(shè)計的總銀濃度。因 此，這表示約54%的銀被取代進入HA結(jié)構(gòu)中。如通過VPS處理之后的XRD所證實的，來自硝酸 銀離子交換溶液的過量銀被轉(zhuǎn)化為其它的Ag相。
[0175] 表3
[0177] 圖1表示純骱(3)、厶8-骱-以13)、厶8-擬-]\1((3)和厶8-說-!1((1)-涂覆的1^6厶14￥圓盤樣 品的掃描電子顯微鏡照片，其顯示涂層的表面外觀。一般而言，所有涂層看上去是均勻的并 且覆蓋T i 6A14V基底。在含銀HA涂層與純HA涂層之間沒有明顯的差異。HA和Ag-HA-H樣品的 橫截面表明涂層的厚度是約80μπι(圖2)。在遍及Ag-HA-H樣品的涂層的不同位置處測量銀濃 度，如通過〃χ〃標記所示。
[0178]表4中定量能量分散X-射線分析(EDXA)顯示涂層中的Ca/P比和Ag含量。每個樣品 使用至少10-15個隨機選擇的區(qū)域，以收集用于該定量分析的光譜。Ca/P比隨著銀含量的增 加而減小，這表明Ag在HA晶格中的取代隨著Ag在涂層中的增加而增加。此外，經(jīng)鑒定，Ag穿 過Ag-摻雜的涂層的厚度(圖2;表5)。
[0179] 摻雜的HA涂層的Ag含量高于通過ICP所測量的Ag含量(表3)，這可能是由于與EDXA 分析相關(guān)的表面粗糙度后生現(xiàn)象(surface roughness artifacts)。
[0180] 表4利用EDAX的Ca/P比和銀含量分析
[0182]表5通過EDXA測量的穿過涂層厚度的Ag濃度。該樣品的位置和相應(yīng)部位示于圖2 中。
1_υ?Β4」 λκυ結(jié)米至仕衣b屮。便用Kietveld棺1丨多wietveld retinement;址仃疋童力、個/Τ。 除了HA相之外，在所有涂覆樣品中鑒定到Ca3 (PO4) 2CaO (磷酸四鈣，TTCP)雜質(zhì)相。在對照的 純HA-涂覆樣品中沒有檢測到Ag。摻雜的HA涂層中的Ag含量接近示于表1中的設(shè)計Ag含量。 Ag的損失或蒸發(fā)在VPS處理期間是最小的。此外，Ag添加到HA涂層中不顯著改變Ag-HA-L和 Ag-HA-M-涂覆樣品的相組成;然而，相比對照的純HA-涂覆樣品，高Ag摻雜的HA涂層（SPAg-HA-H)顯示輕微增加的HA相和減少的TTCP相。
[0185]表6VPS-涂覆樣品的相測定和組成 [0186]定量相分析:重量分數(shù)(wt % ) 樣品 Caf0(PO4)6(OH)2 Ca3(FO4)2CaO Ag HA 83.9± 0.6% 16.1± 0.5% ND*
[0187] Ag-HA-L 83J±0.8o/〇 15.8± 0.6*? 0.3±0.1% Ag-HA-M 83.3±0.8% 15.6±0.5% 1.1 ±0.2 % Ag-HA-H 85.8 士 0.9% 11.6±0.4% 2.6±0.2%
[0188] * ND:未檢測到
[0189] 另外，利用Scherrer公式計算HA相和Ag相的點陣參數(shù)和晶粒大小。這些結(jié)果描述 在表7中。使用半峰寬度（FWHM)數(shù)據(jù)連同Scherrer公式來測定平均HA和Ag晶粒大小。 Scherrer公式通過下式給出：
[0190]
[0191 ]其中λ是X-射線波長，β是FWHM，以及Θ是布拉格衍射角。
[0192]表7涂覆樣品的點陣參數(shù)和晶粒大小
[0194] 值得注意的是，所有涂覆樣品（包括摻雜Ag的HA涂層)與化學計量標準HA相比具有 顯著更高的c/a比（表7)。這表明HA和Ag-HA-涂覆樣品是非化學計量的，這通過示于表4中的 Ca/P比來證實。
[0195] 利用Scherref公式，VPS涂層中的平均HA晶粒大小范圍是40.8nm至57 .Onm。涂層中 的晶粒大小與Ag含量之間沒有相關(guān)性。涂層中的平均Ag晶粒大小也處于納米級，范圍為 37.6nm至56.4nm。在VPS處理之后，Ag或銀化合物轉(zhuǎn)化為納米結(jié)晶金屬Ag。在熔融或部分熔 融的HA或Ag-HA粉末經(jīng)歷等離子體并迅速沉積到基底上之后，由快速冷卻產(chǎn)生這種納米結(jié) 晶HA相和金屬Ag相。因此，沒有時間發(fā)生晶粒生長。
[0196] 拉伸附著強度結(jié)果在圖3中報告。Ag-HA-H-涂覆樣品的拉伸附著強度在所有測試 樣品中是最低的，并且不滿足ISO要求(其要求最小粘合強度為15Mpa)。小于或等于I wt% 的Ag添加（即，Ag-HA-L和Ag-HA-M)不顯著影響涂層的拉伸附著強度。在涂層內(nèi)發(fā)生所有的 破壞。在含銀HA涂層與純HA涂層(示于圖4的純HA和Ag-HA-H)之間不存在斷面外觀上的明顯 差異。
[0197] 銀在PBS中的釋放曲線示于圖5中。其顯示，在37°C下，在早至24小時所有涂覆樣品 釋放Ag到PBS中。所釋放的Ag在PBS中的濃度隨時間而逐漸增加，直至第7天。釋放進入PBS中 的Ag的量是Ag劑量依賴性的。Ag-HA-H-涂覆樣品釋放最高量的銀進入PBS中，而Ag-HA-L-涂 覆樣品釋放最低量的Ag。
[0198] 實施例2
[0199] 利用硝酸銀溶液的羥基磷灰石粉末改性
[0200] 在去離子蒸餾水(DDH2O)中制備兩種不同濃度的硝酸銀溶液，用于硝酸銀溶液與 HA粉末之間的離子交換反應(yīng)。理論上，一些來自硝酸銀溶液的Ag離子將取代來自HA結(jié)構(gòu)的 Ca離子，同時，一些銀離子將被物理吸附到HA表面上。HA粉末中的目標銀含量分別是lwt% 和2wt%。硝酸銀和HA粉末的質(zhì)量列在表8中。
[0201] 表8用于離子交換反應(yīng)的硝酸銀和HA粉末的質(zhì)量
[0203] 首先將硝酸銀（BDH，Cat.#BDH0276-125G)溶解在容納在3升玻璃燒杯中的DDH2O 中，然后根據(jù)表8將HA粉末（MEDIPURE?，MEDIC0AT AG，粒度:-130μπι+45μπι)添加至所制 備的硝酸銀溶液中。將HA和硝酸銀溶液在180RPM下于定軌搖床中在室溫下攪拌3天，以允許 發(fā)生均勻的離子交換反應(yīng)。
[0204]在離子交換反應(yīng)之后，使溶液置于80°C的烘箱中干燥，以蒸發(fā)水。然后將干燥且改 性的HA粉末利用自動化研件和研鉢（Retsch，Mortar Grinder RM200，Newtown，PA)輕微研 磨，以使在干燥過程中形成的附聚物破碎。然后將磨碎的改性HA粉末通過100-325目篩 (W. S.Tyler，Inc.，USA)篩分。丟棄任何大于150μπι或小于45μπι的HA粉末。在100-325目篩之 間收集至少98 %的HA粉末。
[0205] 使用激光衍射粒度分析儀(型號LS13 320,Beckman Coulter，USA)進一步表征銀 改性的HA粉末。所有測量列在表9中。隨著HA粉末中銀含量的增加，平均粒度輕微增加。低和 中等銀HA粉末的粒度分布與對照的純HA粉末相似。
[0206] 表9純HA和改性HA粉末的粒度和大小分布
[0208]然后這些銀改性的HA粉末在MedicoatOWtgeilwn,瑞士）用在常規(guī)的真空等離子 噴涂處理中，用于含銀HA涂層。
[0209] 基底制備
[0210]所有基底由研磨-退火的Ti6A14V合金制備。平面圓盤樣品直徑為12.6mm，厚度為 3.1mm。在瑞士 Aarau的S&N對這些試樣將噴砂處理并清潔。
[0211]涂層沉積
[0212] 在瑞士 Miigenwi丨的Medicoat利用常規(guī)的真空等離子噴涂系統(tǒng)施加涂層。純HA粉 末和銀改性的HA粉末兩者的所有噴涂參數(shù)均相同。使用具有Φ12.6mm孔的不銹鋼板來安裝 Ti6A14V試樣。在涂覆過程之后，用異丙醇洗滌如此噴涂的涂層。
[0213] 涂層表征技術(shù)
[0214]場致發(fā)射掃描電子顯微鏡術(shù)
[0215] 按照S0P/MS/131，使用裝備有雙背散射檢測器(Dual BSD)和EDAX Genesis 4000 能量分散X-射線微量分析(EDX)系統(tǒng)的FEI Nova Nan〇SEM200掃描電子顯微鏡(SEM)檢查樣 品。通過自粘性富碳圓盤(self adhesive carbon rich discs)將每個樣品試樣的所有三 個樣品安裝在25mm直徑的錯樣品粧(pin stub)上。利用低真空條件(0.6-1.0托，水蒸氣）， 在使表面充電（surface charging)最小化以及使表面信息最大化(使電子束穿透最小化） 的10KV的中等加速電壓下，檢查樣品是未涂覆的(無濺射涂層）。
[0216] 用于獲得EDX數(shù)據(jù)的分析條件是10KV加速電壓，斑大小5.5,其中最終孔徑(final aperture)在位置3,并且在20%至39%檢測系統(tǒng)死時間（接近最佳條件），X-射線計數(shù)率為 約1500-4000計數(shù)/秒。EDX微量分析在10KV加速電壓下進行，因為這為該研究提供了從感興 趣的化學元素激發(fā)X-射線所需的最小電子束能量，同時嘗試使通過材料表面的樣品穿透最 小化。用低真空檢測器(LVD)獲得高分辨率二次電子成像，用氣體分析檢測器(GAD)獲得高 分辨率背散射電子成像。以未壓縮TIFF格式記錄代表性區(qū)域的數(shù)字圖像。利用Image Pro Plus軟件來估計樣品HA1-Ag/HA(T0035B)和HA2-Ag/HA(T0035C)中富含銀的材料的大小，使 用SEM圖像比例尺(scaIe bar)來提供空間校準。
[0217] X-射線衍射
[0218] 利用X-射線衍射(XRD)來表征結(jié)構(gòu)和相組成。該分析在瑞士的瑞士聯(lián)邦材料監(jiān)測 與石開究實驗室（Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research)進 行。利用銅X-射線源，在20°與60°之間以0.02°的步長測量XRD圖形。在每一步測量信號3秒， 并且以每秒鐘計數(shù)(cps)給出強度。以下述順序使用狹縫和過濾器：lmm、〇.5mm、Ni過濾器和 0.2mm。在所噴涂的涂層上而不是在刮自表面的粉末上測量XRD(如IS013779-3中所述）。通 過修改版本的ASTM F 2024-00和ISO 13779-3標準分析羥基磷灰石涂層的XRD圖形。不適合 直接應(yīng)用這兩種標準測試方法，因為銀的存在使結(jié)果不明顯。修改用于分析涂層的標準和 方法的原因在結(jié)果部分進行討論。參比材料是羥基磷灰石(HAref76/800/7h)、Al2〇3(Alpha Aesar 99.99%)和銀板(99.95%)。
[0219] 涂層對Ti6A14V基底的拉伸附著強度
[0220]使用來自三個組中的每一組的五個直徑為1英寸的Ti6A14V試樣作為沉積HA或摻 雜Ag的HA涂層的基底，以與ASTM F1147中所述的方式相似的方式評價涂層的拉伸附著強 度。
[0221]每個試樣的背面和測試粧的端部均用80-砂紙輕微打磨，以增強環(huán)氧附著強度。用 丙酮清潔試樣的背面(即，未涂覆的表面），并使其風干2-3分鐘。
[0222]在背表面上使用一層FM1000粘合劑以及在涂覆表面上使用一層FM1000粘合劑，使 拉伸測試粧粘著至每個試樣的相反表面。這通過以下方式來完成:將該結(jié)構(gòu)裝配在固化夾 具中，并在2.31bf (10N)的靜重載荷下，于338° F(170°C )的溫度下，將該夾具在對流傳熱爐 中放置130分鐘(或者，如果兩個夾具同時放在爐中則為135分鐘），以熱固化該膠。在從爐中 移出夾具并使其冷卻至室溫之后，去除靜重，并從夾具中取出該結(jié)構(gòu)。
[0223] 通過使每種結(jié)構(gòu)在0.10in/min(2.5mm/min)的移位速度下經(jīng)歷拉伸載荷直到破 壞，來測試每種結(jié)構(gòu)。記錄每種結(jié)構(gòu)的高峰載荷和破壞方式。通過用高峰載荷除以試樣的橫 截面積來測定拉伸附著強度。測試之后，檢查每個試樣，以確保膠沒有滲入基底，膠滲透入 基底表示無效的試驗。
[0224] 結(jié)果和討論
[0225] SEM/EDX
[0226]圖6a至圖6c顯示在低放大倍數(shù)下每種不同樣品的二次電子圖像，提供了每種樣品 類型的概況。在每種樣品類型的表面外觀上沒有看到定性差異。所述表面具有圓形的、無定 形的混合形態(tài)，具有一些聚集的成角微粒(angular particulates)區(qū)域，這表明在涂覆過 程中使用的粉末原料熔融不完全。這與使用熔體噴涂沉積工藝(如真空等離子沉積)來涂覆 金屬試樣一致。
[0227]圖7a至圖7c顯示每種樣品的表面形態(tài)的較高放大倍數(shù)二次電子圖像。在每種樣品 上可以看到混合形態(tài)，其中無定形狀材料與一些細小的成角微粒都存在。在HA層的表面上 存在顯微裂紋（圖7c中明顯）。在所有樣品上觀察到相似的微粒材料，并且無論樣品類型或 放大倍數(shù)如何，其表面外觀上沒有明顯的定性差異，盡管在二次檢測器圖像和背散射檢測 器圖像中的背散射電子信號揭示在樣品Ag-HAl和Ag-HA2中另外存在微米級和納米級銀顆 粒。
[0228]圖8a至圖8c顯示在低放大倍數(shù)下每種不同樣品的背散射電子圖像，提供了每種樣 品類型的概況。在含銀樣品上可以看到若干明亮斑點/顆粒。從較高平均原子序數(shù)(Z)構(gòu)成 的材料背散射更多的電子，這在背散射電子圖像上產(chǎn)生明亮區(qū)域。圖8b和8c中的較明亮區(qū) 域和非常明亮區(qū)域?qū)?yīng)于富含銀的材料的位置(銀化合物比鈣HA具有更高的平均Z，鈣HA在 背散射電子圖像中以較暗區(qū)域表示）。來自每種樣品的較高放大倍數(shù)的背散射圖像示于圖 9a至9c中，其揭示含銀樣品中富含銀的材料的空間分布的精細細節(jié)。
[0229] 如通過背散射電子所顯現(xiàn)，HA對照樣品的組成是均相的（圖9a)。根據(jù)圖9b和9c中 的組成，含銀的樣品Ag-HAl和Ag-HA2顯示是非均相的?？梢钥吹礁缓y的材料的一系列不 同大小，其中在樣品Ag-HA2中存在更多富含銀的材料。對于含銀樣品而言，富含銀的材料的 尺寸的圖像分析估計為約15nm至ΙΟμπι。較高放大倍數(shù)檢查突出了基于銀的微粒的不同形狀 (圖IOa和IOb和圖Ila和lib)。當在高放大倍數(shù)下觀察時，顯示每種樣品（如圖9c中的橙色圓 環(huán)，以及圖12中清晰可見的）上的淺灰色區(qū)域是由很多分散在鈣HA表面處或鈣HA表面之下 的納米級銀微粒組成。
[0230]圖13a顯示通過EDX微量分析獲得的元素點圖，而樣品Ag-HA2的相應(yīng)區(qū)域的背散射 圖像示于圖13b中。該點圖證實了對應(yīng)于富含銀的材料的示于摻雜銀的樣品的背散射圖像 中的明亮特征和淺灰色特征(EDX圖的藍色區(qū)域)的證明。
[0231] 圖14a-b顯示來自Ag-HAl樣品和Ag-HA2樣品的EDS光譜。箭頭指示銀的峰能量。其 顯示Ag-HA2在涂層中具有更高的Ag含量。
[0232] 圖15顯示HA2樣品上的離散的明亮顆粒的EDX光譜（圖像中用〃x〃標記的斑點）。這 些區(qū)域中的銀濃度比沒有離散的明亮顆粒的區(qū)域中的銀濃度高得多，如在下面的圖像中所 示。這些明亮區(qū)域和所伴隨的Η)ΧΑ光譜證實了先前經(jīng)由XRD分析所發(fā)現(xiàn)的金屬顆粒的存在。
[0233] HA2樣品上遠離離散的明亮顆粒的涂層區(qū)域也經(jīng)由EDXA進行評價，如在圖16a_c中 所示。這些缺乏明亮離散顆粒的區(qū)域也顯示銀的存在，盡管銀以低得多的濃度存在。這證實 了在HA基質(zhì)內(nèi)存在銀取代，如先前通過XRD和ICP分析所示。
[0234] X-射線衍射
[0235] 定性分析
[0236] 圖17中給出三種樣品的XRD圖形。樣品HA顯示羥基磷灰石的所有預期峰。Ag-HAl和 Ag-HA2樣品顯示相同的HA峰，但是增加了在38.15°處的峰(在圖17中，箭頭指示峰），其與金 屬銀一致。在31.1°處觀察到寬峰。該峰可能歸因于非晶相或α-磷酸三鈣(α-TCP)或β-磷酸 三鈣(P-TCP)JS. 15°處的峰是來自銀(Ag)的衍射，插圖顯示該峰的放大圖像。
[0237] 3.3.2結(jié)晶度分析
[0238] 通過ASTM F 2024-00和ISO 13779-3標準來測量結(jié)晶度。兩種方法的結(jié)果呈現(xiàn)在 表10中。ASTM F 2024-00測量相比于外標(Q-Al2O3)的38.5°與59°之間的峰的相對強度。這 些峰未被羥基磷灰石中發(fā)現(xiàn)的普通雜質(zhì)卷積(convoluted)，但是這些峰的相對強度比主要 峰低，因此該方法較不靈敏。ISO 13779-3標準測量10個最強峰相比于100 %羥基磷灰石參 考的相對強度。這些測量在'所噴涂的（as sprayed)'樣品上進行，而不是在刮自表面的粉 末(如在I SO 13779-3中所規(guī)定)上進行。
[0239] 3.3.3 銀分析
[0240] 通過相比于純銀樣品的相對強度來測量兩種樣品Ag-HAl和Ag_HA2的銀含量。表10 中給出銀含量的結(jié)果。Ag-HA 1樣品的銀含量為2.0 ± 0.5 %，Ag-HA2樣品的銀含量為2.5 土 0.5%〇
[0241] 表10.結(jié)晶度、β-TCP和銀含量
[0243] 3.5涂層對Ti6A14V基底的拉伸附著強度
[0244] 圖18中報告拉伸附著強度結(jié)果。在所有測試樣品中，Ag-HAl-涂覆樣品的拉伸附著 強度是最低的，但是即使該組的最低值仍滿足ISO要求(其要求最小粘合強度為15Mpa)。在 涂層內(nèi)發(fā)生所有的破壞。在含銀HA涂層與純HA涂層之間的斷面外觀上沒有明顯差異。
[0245] 實施例3用于生物醫(yī)療應(yīng)用的梯度涂層
[0246] 圖19顯示通過下述方法制備的本發(fā)明實施方式的實例(植入物基底（1510)[例如 Ti6A14V]，其具有含VPS HA(1512)和VPS AgHA(1514)的梯度涂層，頂層PLGA涂層含有β-TCP、Ag和布比卡因（1516)):
[0247] l.HA/Ag-HA涂層制備:利用離子交換反應(yīng)對Ag-HA粉末(45-125μπι)進行改性。涂層 工藝參數(shù)與在我們的醫(yī)用植入物制造工廠制備的標準真空等離子噴涂HA涂層相同。先后施 加 VPS HA涂層和VPS Ag-HA涂層。所涂覆的樣品準備用于PLGA涂層。
[0248] 2.銀改性的β-TCP粉末制備：
[0249] 1).將0.5gf3-TCP粉末(D5q約3μπι)和145.8mg硝酸銀溶解在55mL去離子蒸餾水中并 在60°C攪拌1小時。
[0250] 2).在60°C下使水蒸發(fā)過夜。
[0251] 3).然后碾磨干燥粉末?；蛘?，也可以將銀改性的β-TCP凍干，以除去水，且所述碾 磨步驟不是必要的。
[0252] 4).然后將銀改性的粉末隨后在400°C下燒結(jié)2小時。
[0253] 3 .PLGA 溶液制備：
[0254] 1).將〇.75g PLGA粒料(pellet)(85:15)溶解在15mL二氯甲烷中并攪拌過夜。
[0255] 2).將0.25g銀改性的β-TCP和IOOmg布比卡因粉末溶解在PLGA溶液中并攪拌過夜。
[0256] 4.?1^^涂層施加：將￥?3骱八?3 48-骱涂覆的116414￥基底浸入?1^^溶液中并垂 直取出，然后在空氣中干燥過夜。
[0257] 結(jié)果:頂部PLGA層的表面形態(tài)示于圖20和21中。從EDXA光譜獲得的定量分析示于 表11中。
[0258] 表11.頂部PLGA涂層的EDXA結(jié)果 L〇26〇」 實施例4
[0261] 圖22顯示本發(fā)明的另一實施方式(植入物基底（1810)[例如Ti6A14V]，其具有含 VPS HA(1812)和VPS AgHA(1814)的梯度涂層，并且一層PLGA涂層含有i3-TCP、Ag和布比卡因 (1816)，以及PLGA珠層含有β-TCP、Ag和布比卡因（1818))。
[0262] 這是證明Ag和布比卡因的量和釋放持續(xù)時間可以通過在PLGA涂層的頂表面上添 加 PLGA珠而增加總的涂覆表面積來控制的實例。已知布比卡因在身體環(huán)境中具有迅速的釋 放曲線。為了具有連續(xù)的延長釋放，將布比卡因并入PLGA珠中以減慢其在身體環(huán)境中的降 解速率。
[0263] 方法
[0264] I. PLGA 珠制備：
[0265] 1)以與實施例3相同的方式制備銀改性的β-TCP粉末。
[0266] 2)將0.25g銀改性的β-TCP和IOOmg布比卡因粉末溶解在PLGA溶液中（0.75g PLGA 在15mL二氯甲烷中）并攪拌過夜。
[0267] 3)將5g十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解在500mL去離子蒸餾水中。
[0268] 4)將含銀的改性β-TCP和布比卡因的PLGA溶液在劇烈攪拌下逐滴添加至SDS溶液 中。在I %SDS中攪拌24小時后，洗滌并收集從水-油-水雙重乳化形成的珠。
[0269] 5)將所收集的PLGA珠施加到也含銀的改性β-TCP和布比卡因的頂部PLGA涂層上。
[0270] 6)在70 °C下使PLGA珠與PLGA涂層一起燒結(jié)12小時。
[0271] 結(jié)果:表面形態(tài)示于圖23、24和25中。利用EDXA分析表面組成，結(jié)果示于表12中。
[0272] 表12:頂部PLGA涂層的EDXA結(jié)果
[0274] 實施例5釋放曲線
[0275] 分別通過ICP分析和紫外光譜法來證實Ag、Ca和布比卡因從制備的涂層中的釋放。
[0276] 將涂覆樣品在37°C下浸在3mL PBS中24和48小時。在每個時間點，用分光光度計 (Nanodrop，Thermo)在265nm處測量布比卡因的釋放。通過將適量的藥物溶解在I 3BS中制備 布比卡因標準品。PBS用作空白。布比卡因濃度示于表13中。
[0277] 表13:在24小時和48小時，PBS中的布比卡因濃度
[0279] 在24小時和48小時，PBS中的Ag、Ca和P濃度示于表14中。
[0280] 表14:在24小時和48小時，PBS中的銀和鈣濃度(ppm)
[0282] 降解研究證實涂層能夠釋放用于鎮(zhèn)痛效應(yīng)的布比卡因、用于抗微生物效應(yīng)的Ag離 子以及用于骨傳導效應(yīng)(osteoconductive effect)的Ca〇
[0283] 實施例6合成及表征方法的實例
[0284] 合成
[0285] I).VPS梯度涂層：Ti6A14V基底+純VPS HA層+3%VPS AgHA層
[0286] 2).將PLGA( 85:15)粒料溶解在二氯甲烷中并攪拌過夜
[0287] 3).在硝酸銀溶液中浸漬并攪拌β-TCP 2小時，以使離子交換反應(yīng)發(fā)生
[0288] 3).將布比卡因添加至上述TCP+硝酸銀溶液中
[0289] 4).將布比卡因+TCP+硝酸銀溶液干燥過夜
[0290] 5).將布比卡因 +TCP+硝酸銀的干燥粉末添加至溶解的PLGA溶液中，并攪拌過夜
[0291 ] 6).使用上述含有布比卡因 +TCP+硝酸銀的PLGA溶液浸涂VPS梯度涂層
[0292] 表征
[0293] I).SEM頂視圖和橫截面
[0294] 2) .EDAX-頂層和橫截面的元素組成(Ca、P、Ag)
[0295] 3).XRD-頂層的相組成(主要檢測布比卡因）
[0296] 4).XRD的另選方案:將頂層溶解在PBS中（3天），隨后分光鏡分析布比卡因
[0297] 實施例7合成及表征方法的其它實例
[0298] 合成
[0299] 1).溶膠-凝膠浸涂方法來制備Ag分級涂層，即Ti6A14V基底+純Ca-P層+2%Ag-Ca-P層
[0300] 2).在氯仿中溶解PLGA (8 5:15)粒料
[0301] 3) ·添加鎮(zhèn)痛藥(例如非處方泰諾(over counter Tylenol))和Ag_CaP(2wt%Ag) 粉末至PLGA中
[0302] 4).使用所制備的PLGA聚合物溶液浸涂所述溶膠-凝膠Ag-Ca-P樣品。
[0303] 表征
[0304] 1) ·在PBS和SBF中降解之前和之后的SEM頂視圖
[0305] 2) .ToF-SIMS，以獲得深度信息
[0306] 3). XRD-相組成
[0307] 4).在SBF中的體外生物活性評價(3天）
[0308] 5) ·在PBS中溶解(24h、48h、72h)，以測量Ag濃度。
[0309] 實施例8具有改性抗微生物磷酸鈣涂層的多孔表面植入物的骨整合。
[0310] 這里報告了用或者不用溶膠-凝膠形成的Ag改性的磷酸鈣薄膜覆蓋層（約1微米 厚）制備的Ti6A14V合金多孔表面植入物的機械拔出測試的結(jié)果。簡要概括而言，該研究使 用了4組兔，每組10只，所述兔具有橫向植入其股骨內(nèi)側(cè)課(medial femoral condyles)(與 松質(zhì)骨接界的多孔區(qū)域）中的多孔表面植入物（Endopore?，得自Innova-Sybron Dental Products的牙科植入物）。植入物定位和植入方法類似于在Tache等（2004)，Int J Oral Maxillofac Implants，19:19_29;Gan等（2004)，部分II :Short-term in vivo studies， Biomaterials.25:5313-5321;Simmons等（1999)，J Biomed Mater Res.，47:127_138中描 述的那些，所有參考文獻通過引用并入本文。'測試'植入物(每只動物在右腿或左腿具有一 個-隨機安置)用覆蓋(overlaying)在Ti合金植入物的燒結(jié)多孔表面上的Ag-改性的磷酸鈣 涂層來制備。多孔表面區(qū)域由大約三層Ti6A14V合金粉末(粒度為44至150微米)組成，所述 Ti6A14V合金粉末被燒結(jié)以便形成約300微米厚的多孔層，其孔隙度為35體積百分比（大 約），平均孔徑大小在75至100微米范圍內(nèi)?；ミB的開孔結(jié)構(gòu)適合通過不受抑制的骨向內(nèi)生 長來實現(xiàn)植入物固定。值得注意的是，該顆粒和孔徑大小稍微小于常規(guī)用于矯形植入物的 顆粒和孔徑大小，但是已證實其是可接受的，并且實際上，其優(yōu)選用于出現(xiàn)尺寸限制的牙科 植入物應(yīng)用。
[0311] 溶膠-凝膠形成的磷酸鈣覆蓋層先前已經(jīng)進行了研究(但是沒有Ag+改性），并且觀 察到其以未改性的形式促進更快速的骨向內(nèi)生長(即，增強骨整合）?；谶@些早期研究，由 Smith&Nephew提出并開發(fā)了 Ag-改性的磷酸鈣涂層作為抗微生物和骨傳導涂層，其將增加 骨向內(nèi)生長進入多孔表面植入物，并且降低早期植入后時期（early post-implantation period)期間，在植入物部位處感染的可能性。該增加的抗感染性在決定性的早期植入后治 愈期期間是合意的，因為導致局部感染和炎性反應(yīng)的微生物進入將抑制骨向內(nèi)生長并可能 導致植入失敗。因此，在該早期期間降低細菌感染的可能性在改進設(shè)計為通過骨向內(nèi)生長 固定的矯形植入物的可靠性方面將具有可觀的益處。
[0312] 材料&方法
[0313] 調(diào)查兩種不同的含Ag+的磷酸鈣配制物。在本報告中這些被稱為'低'和'高18水 平。（在下面呈現(xiàn)的結(jié)果中，LC =低Ag+(0.9wt% )磷酸|丐，HC =高Ag+(2.5wt% )磷酸f丐涂 層）。對動物研究進行設(shè)計，以致將LC植入物放置在20只兔的股骨髁中，其中'對照'植入物 (即，無磷酸鈣(NC)溶膠-凝膠涂層)在另一股骨中，類似地相對于'對照'植入物將HC植入物 放置在其余20只兔中。在植入物放置之后，將來自每個組的十只兔供養(yǎng)(maintain)9天，然 后使其安樂死，而另外十只兔在處死之前被供養(yǎng)16天。這提供了植入9天后的10個LC植入 物，用于10個NC 9-天植入物進行對比；以及16天的類似數(shù)量的LC植入物，用于與NC植入物 進行對比。類似地，在9天和16天植入物停留期后研究了兩組HC植入物，每組10個，并與NC植 入物進行比較。
[0314] 將動物處死之后，通過機械拔出測試(如在上面討論的先前報告的研究中）以及一 些植入物-組織樣品的組織學檢查和評價，來評價就導致穩(wěn)固植入物固定的有效骨向內(nèi)生 長而言的植入物性能。另外，通過在掃描電子顯微鏡中二次電子成像檢查一些拔出的植入 物，以表征植入物-組織界面區(qū)以及鑒定可能存在的任何骨狀組織特征或纖維組織特征。機 械拔出測試的優(yōu)點在于該測試提供完整界面上的信息，而不是提供通過顯微鏡檢查所觀察 到的選擇區(qū)域上的信息。在動物安樂死之后，將用于機械測試的所有樣本貯存在鹽溶液中， 并且在處死2小時內(nèi)解剖股骨髁區(qū)域并進行測試。
[0315] 對如上所述每組10個樣品中的8個進行機械測試，將其余的兩個樣品用于組織學 樣品制備。拔出測試涉及將骨-植入物樣品安裝在確保植入物適當對準的定制的夾具中，并 在移位控制(displacement control)下以lmm/min的速度施加拔出力。多孔表面植入物的 逐漸變細(tapered)的形狀以及仔細的樣品對準確保了作用在骨-植入物接合處的可能有 助于所測量的拔出力和界面剛度(surf ace stiff ness)的摩擦力得以避免。最大拔出力和 載荷-移位曲線的最大切線斜率用于測定抗拔出性和界面區(qū)（surface zone)剛度。
[0316] 將兔處死之后收集如上所述的每組10個樣品中兩個，并將其固定在10%緩沖福爾 馬林中，并進行處理以包埋在甲基丙烯酸甲酯中。使用金剛石扁平刀片切開所得的塊，以制 備沿著植入物的長軸在其正中平面厚度為大約200微米的切片。然后將這些樣品安置在載 玻片上并仔細研磨和拋光，以提供厚度約30至40微米的非脫鈣切片。將'薄'切片用0.3%甲 苯胺藍和2%硼酸鈉的1:1混合物在50°C下染色15分鐘，然后在0.3%亮綠(在2 %乙酸中）中 于室溫下染色3分鐘。通過光學顯微鏡術(shù)檢查切片并如下所述記錄外觀。
[0317] 針對不同的植入物對，對于磷酸鈣涂覆的'測試'植入物對未涂覆的'對照'植入 物，進行最大拔出力和已測界面區(qū)剛度值的統(tǒng)計分析(方差分析，其中植入物設(shè)計作為一種 變量參數(shù)）。因此，將9-天LC植入物與放置在對側(cè)兔股骨髁中的相應(yīng)的9-天NC植入物進行比 較，將9-天HC植入物與相應(yīng)的9-天NC植入物進行比較，以及以相同方式將16-天成對植入物 進行比較。另外，將9-天NC植入物與16-天NC植入物進行比較，以及將9-天HC植入物和16-天 HC植入物進行類似比較。
[0318] 結(jié)果&討論
[0319] 來自目前研究的機械測試結(jié)果呈現(xiàn)在表15中。
[0320]表15機械拔出測試概述 摔品類型 植入時期(夭)界面剛度(N/mm) 拔出力(N) (平均±SD) (平均±SD) 低 Ag-CP 9 3?1 ± 140 192 ± 1161 高 Ag-CP 9 355 ± 158 193 ± 69 #
[0321] 對照-無 CP 9 307 ± 99 * 177 ±66:1； 低 Ag-CP 16 355 ± 89 402± 118十 高 Ag-CP 16 432 ± 75 413 ± 147 # 對照-無 CP 16 371 ± 75 * 469 ± 120J
[0322] * 顯著差異(ρ = 0·048)
[0323] *f、$、#各對之間的顯著差異(ρ<0·01)
[0324] 統(tǒng)計檢驗表明，對于所有的樣品對而言，'測試'和'對照'植入物之間在最大拔出 力和界面剛度方面都沒有顯著差異(顯著差異對應(yīng)于P<〇.05)。然而，對于LC和HC植入物兩 者而言，相比于9-天樣品，16-天植入物的拔出力具有非常顯著的增加(p<0.01)。從9天到 16天界面區(qū)剛度也顯示增加，盡管該增加是顯著的（p = 0.048)，但是該差異并非幾乎與針 對抗拔出性所觀察到的一樣大。這種有趣的結(jié)果表明，界面區(qū)發(fā)展了更強的對裂紋擴展和 破裂的抵抗性，因為從9天到16天形成更廣泛的組織和骨向內(nèi)生長（即，形成'更強韌的'界 面區(qū)）。從9-天到16-天植入期的增加與先前所報告的該兔股骨髁植入模型一致。
[0325] 有趣地，Ag+-改性的磷酸鈣覆蓋層導致16-天植入期之后的界面剛度值盡管平均 高于9-天植入物的值，但是并非顯著不同。對于所燒結(jié)的非磷酸鈣涂覆的以及Ag+-改性的 磷酸鈣涂層(低和高Ag+)而言，這種對9天的植入物移出的抵抗性表明，對于涂覆植入物，已 經(jīng)發(fā)生組織(骨）向內(nèi)生長。
[0326] 拔出植入物的SEM檢查
[0327] 通過二次電子發(fā)射掃描顯微鏡術(shù)檢查已經(jīng)進行機械測試的一些9-天植入物。
[0328] 圖26到29顯示八張所收集的圖像。圖26a&b顯示從9-天植入兔#1A得到的磷酸鈣-涂覆的較低Ag+植入物(CL-9)的圖像。盡管該植入物表現(xiàn)出較低的界面剛度和拔出力，但是 對于展示礦化組織特性的區(qū)域，二次電子圖像顯示了廣泛的組織附著和向內(nèi)生長。圖27a&b 是從同一動物的另一個膝部拔出的未經(jīng)涂覆的'對照'植入物(NCL-9)的圖像。相比于來自 對側(cè)肢體的涂覆植入物(CL)，該植入物表現(xiàn)出更高的剛度和拔出力，并且顯示了9天植入時 期中預期的廣泛組織附著和礦化組織向內(nèi)生長。圖28a&b和29a&b是所得到的含較高Ag+的 磷酸鈣涂覆植入物（圖28a&b)的圖像和相應(yīng)的未涂覆的 7對照7植入物的圖像（圖29a&b)的 圖像；（兔#1B，即，分別含有植入物CH-9和NCH-9)。
[0329] 非機械測試植入物的BS-SEM檢查
[0330] 使用BS-SEM來收集組織-植入物界面區(qū)的圖像，其中在經(jīng)檢查的切片上進行定量 圖像分析。對于定量評估(Quant imet圖像分析程序），選擇來自植入物基底，沿著其多孔涂 覆區(qū)域長度的約220微米寬的包層(enveloped 即，接近沿著植入物長度的多孔涂層末端但 是不包括更外周區(qū)域的包層寬度;植入物端部也被排除）。利用Quantimet圖像分析軟件分 析該區(qū)域。測定孔內(nèi)的百分比骨面積（即，％ [骨面積/孔面積])。該程序也允許測定多孔涂 層的百分比孔隙率，其標稱設(shè)計為35至40體積百分比。
[0331] 圖30至35顯示所有樣品類型的典型BS-SEM圖像。對于具有CP覆蓋層的植入物以 及'對照'植入物，BS-SEM圖像清楚顯示在兩個時期的礦化組織（骨）向內(nèi)生長（淺灰色區(qū) 域）?？衫每紫秲?nèi)的骨百分比的定量圖像分析的結(jié)果呈現(xiàn)在表16中。對于所分析的切片， 將植入物長度分成四個部分進行分析，從而允許較高放大倍數(shù)圖像用于分析。然后對四個 測量進行平均，以給出每個植入物的百分比骨向內(nèi)生長(和百分比孔隙率）。來自所有切片 的數(shù)據(jù)包括在表16中，并且顯示沿著植入物長度所觀察到的變化。鑒于其中放置植入物的 松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)，這并不令人驚訝。測定每種植入物的平均偏差和標準偏差。進行單因素方差 分析，測定每只兔的對側(cè)肢體中的植入物之間是否存在統(tǒng)計差異。統(tǒng)計學顯著被認為在口< 0.05。通過Quantimet成像軟件容易區(qū)分不同的區(qū)域(骨，Ti合金顆粒和未填充孔，或者至少 未用骨填充），這使得能夠客觀測定在可利用孔內(nèi)的百分比骨填充。僅進行動物內(nèi)比較（即 每只動物的左腿和右腿）。這樣提供7套用于比較，包括所有不同的條件(在9天和16天的低 S-CP、高S-CP、對照），其中每一種條件評估兩只動物，一個除外。遺憾的是，一個丟失的植入 物(兔2C)不能包括在內(nèi)。
[0332]表16BS-SEM檢查的定量圖像分析的概括
[0334] 盡管少量的樣品被分析，但是定量圖像分析的確提出一些令人感興趣的額外發(fā) 現(xiàn)。
[0335] 9天數(shù)據(jù)表明，在兩只兔（8A和8B)中，相比于其各自的'對照'植入物（無 CP覆蓋 層），S-CP-改性的植入物(8A，低S-CP，以及8B，高S-CP)的％骨向內(nèi)生長顯著更高。被分析的 另外兩只9天兔沒有顯示顯著的差異。
[0336] 在16天，CP-改性的植入物與'對照7植入物之間在骨向內(nèi)生長方面不存在顯著差 異。
[0337] 如前，這些發(fā)現(xiàn)表明，S-CP-覆蓋層不抑制骨向內(nèi)生長。事實上，BS-SEM圖像和定量 圖像分析顯示，添加 S-CP覆蓋層可促進更快速率的骨向內(nèi)生長。
[0338] 定量圖像分析也用于證實植入物的百分比孔隙率。如使用Quantimet軟件所測定 的，所分析的17個切片的百分比孔隙率等于43.1±2.7%。
[0339] 兔植入物的組織學評估
[0340] 所檢查的切片從16個組織-植入物塊制備并在研究中使用，所述16個組織-植入物 塊收獲自選自40只兔的8只兔。在這些用于組織學切片制備的16個樣品中，植入物不存在于 一個塊中。推測該植入物(樣品2C，16-天'低'Ag+)在放置后還未發(fā)生骨整合，但是從植入部 位發(fā)生迀移。對其余64個植入物進行機械測試(拔出測試），以測定植入物-骨界面區(qū)的剪切 強度和界面剛度，如上所討論。
[0341] 在已經(jīng)進行高或低處理的植入物與對照(未經(jīng)處理的）之間沒有明顯的差異。在所 有動物中，隨著時間的骨向內(nèi)生長的成熟是相同的。對于已經(jīng)進行處理的植入物沒有觀察 到反應(yīng)，并且在周圍的骨中沒有明顯的細胞死亡。圖36至41顯示每種條件的代表性顯微鏡 照片，其顯示所有植入物的骨向內(nèi)生長的區(qū)域。該發(fā)現(xiàn)與上面報告的機械拔出測試結(jié)果一 致。
[0342] 概括&結(jié)論
[0343] 1.拔出測試結(jié)果和拔出的植入物的SEM圖像證實，對于具有Ag+-改性的磷酸鈣溶 膠-凝膠形成的涂層覆蓋層的多孔表面植入物而言，到9天出現(xiàn)導致穩(wěn)固的植入物固定的組 織向內(nèi)生長。
[0344] 2.拔出試驗表明，較低或較高添加 Ag+的改性涂層表現(xiàn)相似。
[0345] 3.如所預期的，用于移出植入物的拔出力隨著植入時期的加長而增加，相比于9-天的樣品，記錄到16-天的植入樣品具有顯著更高的拔出力。然而，9天和16天植入樣品的界 面區(qū)剛度值沒有顯著差異，盡管16天植入物的平均值更高。
[0346] 4.雖然來自本研究的改性磷酸鈣涂覆的植入物的記錄拔出力與先前研究（Tache 等）中所報告的那些沒有顯著差異，但是觀察到顯著更高的界面區(qū)剛度值。該更高的界面剛 度可能歸因于在先前研究中所使用的植入物更長(9mm對7mm長度）。
[0347] 5.向沉積在多孔涂覆Ti-6A1_4V植入物上的溶膠-凝膠磷酸鈣膜添加 Ag+不抑制骨 的向內(nèi)生長。進行測試的兩種濃度的銀看上去給出相似的結(jié)果。
[0348] 實施例9-HA-Ag涂層的抗微生物活性 [0349] 方法
[0350] 評價來自實施例2的涂層的抗微生物活性。另外，還陰性對照(未經(jīng)涂覆的Ti6A14V 基底)和陽性對照(Acticoat 7(Smith and Nephew)，已知具有抗微生物性能的含納米結(jié)晶 銀的創(chuàng)傷敷料)進行評價。
[0351] 樣品培養(yǎng)方法
[0352] 通過收獲過夜的斜面培養(yǎng)物來制備含有約104cfu/ml的試驗有機體的懸浮液。以 基于ASTM標準E2149-0U用于在動態(tài)接觸條件下測定固定的抗微生物劑的抗微生物活性的 標準測試方法）的方法測試試驗試樣。
[0353] 將樣品置于帶低蒸發(fā)蓋的24孔無菌組織培養(yǎng)板平底中，對于所測試的每個時間 點，每個樣品類型制備四個。另外，建立Acticoat 7的陽性對照樣品和陰性培養(yǎng)物對照(每 個時間點每個(對照）3個重復）。每個樣品接種2ml試驗有機體懸浮液，各平板用石蠟?zāi)っ?封，以使培養(yǎng)物的蒸發(fā)最小化。使樣品于37 °C在150rpm攪拌下孵育有關(guān)的時期，在24、48和 72小時進行聲處理計數(shù)(sonicated counts)。聲處理計數(shù)不適合于陽性和陰性方法對照樣 品。0時間樣品未進行聲處理計數(shù)，因為在沒有時間發(fā)生定居(colonisation)的情況下，它 們不會產(chǎn)生任何有關(guān)信息。
[0354] 對于顯示遠離表面所表現(xiàn)的任何活性的另外的支持信息，在0、24、48和72小時從 試驗接種物進行計數(shù)，以計算懸浮液中的計數(shù)的對數(shù)減少。在所有時間點，進行3個重復取 樣，因為這是所有時間限制所允許的。
[0355] 聲處理計數(shù)
[0356] 洗滌劑溶液中的聲處理是從金屬表面移除所附著的細胞以評估其數(shù)目的公認方 法。本文中，其用來測定是否在具有含銀HA涂層和非含銀HA對照的樣品上觀察到不同的細 菌生長水平。
[0357] 在PBS中洗滌試樣，然后抽吸掉(aspirate off)過量的（試樣），重復該過程另外5 次，總共進行6次洗滌。將試樣置于15ml Falcon試管中的9ml STS(0.85%鹽&1 %吐溫20& 0.4%巰基乙酸鈉）中，并利用聚苯乙烯浮子在聲處理水浴中漂浮。然后將樣品在60Hz下聲 處理10分鐘。
[0358] 在最大回收稀釋劑（Maximum Recovery Diluent，MRD)中將所得聲波處理物 (sonicate)稀釋至 10-5，所有稀釋在雙份Aerobic Count Petrifilm(3M)上鋪開(plated out)。然后在使用petrifilm讀數(shù)儀計數(shù)之前，在32°C下孵育所得膜至少48小時。
[0359] 聲處理計數(shù)結(jié)果
[0360] 圖42和43示出了聲處理計數(shù)的結(jié)果。相比于eMRSA 15(流行性耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌15(epidemiC MRSA 15)，英國醫(yī)院分離物），觀察到在對抗表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)具有更大的表面計數(shù)降低，盡管在72小時時間點觀察到反向生長(grow back)至等于最初的接種和同等的對照的水平。
[0361 ]來自懸浮液的計數(shù)
[0362] 在適當?shù)臅r期之后，從所有樣品的重復1至3取樣Iml接種物，并添加至9ml STS中。 然后將該Iml(接種物)重復兩次鋪板(plated)，對于陰性對照，將Iml在MRD中連續(xù)稀釋，在0 時間稀釋至1〇_ 4,在24小時稀釋至10-5,然后稀釋至10-6,對于涂覆樣品和陽性對照，在所有 時間點，將Iml在MRD中稀釋至10_ 5。
[0363] 對于未經(jīng)涂覆樣品和培養(yǎng)物對照，在0和24小時，分別來自從10_2以及10_3向下的 稀釋在雙份Aerobic Count Petrifilm(3M)上鋪開。對于涂覆樣品，將所有稀釋重復兩次在 Aerobic Count Petrifilm(3M)上鋪板。在計數(shù)之前將所得板在32°C下孵育至少48小時。
[0364] 懸浮液計數(shù)結(jié)果
[0365] 圖44和45示出了懸浮液計數(shù)的結(jié)果。來自懸浮液的計數(shù)可用來計算從零時間的計 數(shù)的降低，并因此用來計算對數(shù)降低。對抗eMRSA 15,較低劑量的銀顯示出極小的殺死，但 是的確使懸浮液中的數(shù)目保持靜態(tài)。較高的銀劑量的確殺死至檢測限并維持其中的數(shù)目。 兩種劑量的銀HA最初殺死表皮葡萄球菌直至低水平，但是在72小時出現(xiàn)有機體反向生長 (grow back)至與最初的有機體相當?shù)乃健?br>[0366] 實施例10-VPS Ag/HA樣品的細胞毒性試驗
[0367] 評價來自實施例2的涂層的細胞毒性。另外，還對未經(jīng)涂覆的Ti6A14V試樣(已知為 無細胞毒性的陰性對照)進行評價。
[0368] 方法 [0369] 材料
[0370] 未經(jīng)涂覆的Ti6A14V試樣
[0371] VPS-羥基磷灰石(HA)試樣-批次T0035A
[0372] 含低劑量銀（1 % )的VPS-HA(HAl)-批次T0035B
[0373] 含中等劑量銀（2% )的VPS-HA(HA2)-批次T0035C
[0374] 聚氯乙烯圓盤-批次T0024-90-02-01
[0375] 高密度聚乙烯圓盤-批次T0024-90-02-02
[0376] Eaglesa-極限必需培養(yǎng)基（α-Minimum Essential Medium Eagles)(α-ΜΕΜ)+10% 胎牛血清-#9696、#9662、#9707
[0377] 胰蛋白酶-EDTA-批號 058K2373
[0378] 錐蟲藍-Sigma T8154批號088k2379和批號047k2349
[0379] Vectashield封固劑，用于利用DAPI的熒光-Vector H-1200批號U0403
[0380] WST-I 試劑-Roche 11644807001 批號 14473200
[0381] 條件培養(yǎng)基的制備
[0382] 利用IS010993指南，計算所有試驗樣品和對照樣品的表面積與體積之比，以測定 每個樣品所需的培養(yǎng)基體積，以制備樣品的液體提取物(稱為條件培養(yǎng)基）。對于HA、HA1、 HA2和鈦試樣，所需的培養(yǎng)基體積是1.23ml/試樣，將四個試樣置于6-孔板的孔(n = 4)中，總 體積為4.92ml WVC和HDPE圓盤所需的培養(yǎng)基體積是1.33ml/圓盤，將四個圓盤置于6-孔板 的孔(n = 4)中，總體積為5.32ml。這些組在6-孔板中的布置是隨機的，以幫助降低板布置的 影響。沿著這些板的邊，6-孔板具有所添加的5.32ml培養(yǎng)基/孔，其充當組織培養(yǎng)塑料器具 組(TCP)，因為該組僅用作試驗對照并且因此無需包括在隨機取樣中。與試驗材料一起孵育 的培養(yǎng)基是α-ΜΕΜ;這五個板在37°C，5%CO 2下孵育7天。
[0383] 細胞接種
[0384] 按照S0P/CB/006,使MC3T3-E1細胞傳代進行計數(shù)。要求以5xl04/cm2接種細胞。以該 密度在2x 96-孔板上接種168個孔，細胞現(xiàn)在是P13。在37°C，5%C02下培養(yǎng)細胞48小時。
[0385] 條件培養(yǎng)基的施用
[0386] 從96-孔板中去除培養(yǎng)基并用100μΙ適當?shù)臈l件培養(yǎng)基替換，n = 6/樣品組/處理/ 對照組。在37°C，5%C02下孵育2x 96-孔板24小時。
[0387] WST-I 試驗
[0388]使用WST-I試劑來量化暴露于條件培養(yǎng)基的細胞的代謝活性。將10μ1 WST-I試劑/ 孔添加至每一個96-孔板中。將板在37°C，5%C02下孵育1小時，搖動1分鐘，然后在 Multiskan讀板儀(資產(chǎn)編號00005247)上分別在450nm和650nm的試驗波長和參考波長處讀 數(shù)。對于每個孔，從試驗波長減去參考波長，并計算和繪制每組的平均值，以表示細胞的代 謝活性(見圖46)。
[0389] 結(jié)果和討論
[0390] 支原體試驗
[0391] 按照S0P/CB/069進行用DAPI染色的支原體試驗。在該試驗中使用的細胞被認為是 支原體陰性的。
[0392] WST-I 試驗
[0393] 在該試驗中，相比于陽性細胞毒性對照組PVC和陰性對照組HDPE，HAl和HA2組刺激 MC3T3-E1細胞的增加的代謝活性。然而，暴露于單獨HA的細胞的代謝活性高于兩種含Ag組 中的任一組。暴露于Ti6A14V組的細胞的代謝活性低于所有含HA組和陰性對照HDPE的細胞 代謝活性。然而，Ti6A14V的確刺激細胞的礦化至陽性對照水平的兩倍的水平。使用TCP組作 為細胞對照組，并且該組中的細胞以與陰性對照HDPE相似的水平代謝。注意，鈦組中的細胞 的代謝活性低于兩個陰性對照的細胞代謝活性，但是存在來自該數(shù)據(jù)集的大的數(shù)據(jù)展開， 如通過誤差條所示。
[0394] 結(jié)論
[0395] 1%和2%銀處的VPS Ag/HA樣品將MC3T3-E1細胞的代謝活性增加至高于陽性和陰 性對照的代謝活性水平的水平。然而，來自這些組的細胞的代謝活性低于單獨HA組中的細 胞。
[0396]技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)被任意上述示例性實施方式所限 制，而是應(yīng)當僅根據(jù)所附的權(quán)利要求及其等價物來定義。
【主權(quán)項】
1. 用于醫(yī)用植入物的涂層，其中所述涂層的至少一部分含有骨整合劑，并且所述涂層 的該相同和/或不同部分含有抗微生物金屬試劑。2. 權(quán)利要求1所述的涂層，其中所述抗微生物金屬試劑作為離散顆粒存在于所述涂層 的至少一部分中。3. 權(quán)利要求1或2所述的涂層，其中所述抗微生物金屬包括銀、銅和/或鋅中的一種或多 種。4. 權(quán)利要求2或3所述的涂層，其中所述離散顆粒是金屬銀或銀化合物顆粒。5. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述金屬試劑作為離散金屬銀顆粒存在于所 述涂層中。6. 權(quán)利要求4或5所述的涂層，其中所述金屬銀顆粒是球形或不規(guī)則形狀。7. 權(quán)利要求6所述的涂層，其中所述金屬銀顆粒的直徑大小為約15nm至約1 Ομπι。8. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述金屬試劑是銀，并作為取代進入所述骨 整合劑中的銀存在于所述涂層中。9. 權(quán)利要求8所述的涂層，其中銀取代的骨整合劑具有遍及所述涂層厚度均勻分布的 銀濃度。10. 權(quán)利要求9所述的涂層，其中所述銀取代的骨整合劑含有按重量計約0.1 %至約 10 %的銀，優(yōu)選按重量計約0.5 %至約3.0 %的銀。11. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述涂層是等離子噴涂層。12. 權(quán)利要求11所述的涂層，其中在還原條件下對含有抗微生物金屬試劑的所述涂層 的至少一部分進行等離子噴涂。13. 權(quán)利要求12所述的涂層，其中在真空中進行等離子噴涂。14. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述抗微生物金屬試劑的濃度足以具有抗 細囷效果。15. 權(quán)利要求14所述的涂層，其中所述金屬試劑的濃度是約0. lwt %至約1 Owt %。16. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述骨整合劑是鈣衍生物。17. 權(quán)利要求16所述的涂層，其中所述鈣衍生物是羥基磷灰石和/或β-磷酸三鈣中的一 種或組合。18. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中含有抗微生物劑的所述涂層的至少一部分 具有遍及所述涂層的該部分的整個厚度分布的抗微生物劑。19. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述涂層厚度大于約Ιμπι，優(yōu)選為約ΙΟμπι至 約200μηι，更優(yōu)選為約30μηι至約1 ΟΟμπι。20. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述涂層對金屬基底的拉伸附著強度大于 或等于15Mpa。21. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述涂層具有一種或多種骨傳導、骨促進 和/或抗微生物性能。22. 任一項前述權(quán)利要求所述的涂層，其中所述骨整合劑被以下物質(zhì)中的一種或多種 取代:碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅和/或鋅。23. 醫(yī)用植入物，其包含至少一個表面，其中所述至少一個表面至少部分被如任一項前 述權(quán)利要求中所述的涂層涂覆。24. 制備抗微生物涂層的方法，其中通過離子交換法或溶膠-凝膠法制備含銀的鈣衍生 物粉末，并且隨后將其等離子噴涂到基底材料上。25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中通過以下方法制備所述含銀的鈣衍生物粉末： a. 將鈣衍生物粉末懸浮在銀鹽溶液中，持續(xù)足以將鈣離子交換為銀離子的時間和溫 度，和 b. 將所述經(jīng)過離子交換并洗滌的鈣衍生物干燥。26. 權(quán)利要求25所述的方法，其中在步驟(a)與（b)之間進行洗滌所述經(jīng)過離子交換的 鈣衍生物粉末的額外步驟。27. 權(quán)利要求24至26中任一項所述的方法，其中所述鈣衍生物是磷酸鈣。28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述磷酸鈣是羥基磷灰石和/或β-磷酸三鈣中的一種 或組合。29. 權(quán)利要求25至28中任一項所述的方法，其中所述鈣衍生物粉末與銀鹽溶液之間的 離子交換反應(yīng)在約20°C至95°C的溫度下發(fā)生約24至168小時。30. 權(quán)利要求25至29中任一項所述的方法，其中所述銀鹽溶液是濃度為10-2-10-4Μ的硝 酸銀或氟化銀，并且硝酸銀與ΗΑ粉末的質(zhì)量比在0.01-0.1的范圍內(nèi)。31. 權(quán)利要求26至30中任一項所述的方法，其中所述含銀的鈣衍生物粉末還被以下物 質(zhì)中的一種或多種取代:碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅和鋅。32. 權(quán)利要求24所述的方法，其中通過以下的溶膠-凝膠法制備所述含銀的鈣衍生物粉 末： (a) 混合鈣、銀和/或磷前體的組合，以獲得均勻的溶膠-凝膠溶液； (b) 在20-95 °C的溫度下將所述溶膠-凝膠溶液老化，持續(xù)合適的時期； (c) 在高于室溫的溫度下干燥并煅燒所述溶膠-凝膠溶液，持續(xù)合適的時期； (d) 將經(jīng)過煅燒的粉末處理成所需的粒度分布，用于隨后的等離子噴涂處理。33. 權(quán)利要求32所述的方法，其中所述鈣前體是硝酸鈣。34. 權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述銀前體是硝酸銀。35. 權(quán)利要求32至34中任一項所述的方法，其中所述磷前體是磷酸二氫銨。36. 權(quán)利要求32至35中任一項所述的方法，其中所述Ag前體的濃度范圍是約0. lwt%至 10wt%，優(yōu)選為0 · 5wt% 至3 · Owt%。37. 權(quán)利要求32至36中任一項所述的方法，其中將氟和碳酸鹽前體與鈣、銀和磷前體混 合，以獲得均勻的溶膠-凝膠溶液。38. 權(quán)利要求37所述的方法，其中所述氟前體是氟化銨。39. 權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述碳酸鹽前體是碳酸銨。40. 權(quán)利要求37至39中任一項所述的方法，其中所述F和/或碳酸鹽前體的濃度為約10 -2-10-3M 〇41. 權(quán)利要求32至40中任一項所述的方法，其中將碳酸鹽、氟化物、硅、鎂、鍶、釩、鋰、銅 或鋅前體或其組合與鈣、銀和磷前體混合，以獲得均勻的溶膠-凝膠溶液。42. 權(quán)利要求24所述的方法，其中在噴涂之前含銀的鈣衍生物粉末配制物的大小分布 基本等于天然的純鈣衍生物粉末。43. 制備抗微生物涂層的方法，其包括將含銀的鈣衍生物粉末等離子噴涂到基底上。44. 權(quán)利要求43所述的方法，其中在還原環(huán)境中進行所述等離子噴涂。45. 權(quán)利要求43或44所述的方法，其中等離子噴涂步驟導致形成金屬銀顆粒。46. 權(quán)利要求45所述的方法，其中所述銀金屬顆粒遍及所述涂層的厚度分布。47. 權(quán)利要求43至46中任一項所述的方法，其中不需要后處理熱處理來進一步鞏固所 述涂層或使所述涂層與基底粘合。48. 權(quán)利要求43至47中任一項所述的方法，其中所述涂層形成自含銀的鈣衍生物粉末 的均勻配制物。49. 權(quán)利要求48所述的方法，其中不需要將所述含銀的鈣衍生物粉末與其它含銀粉末 共混，以將銀并入所述涂層中。50. 權(quán)利要求43至49中任一項所述的方法，其中所述鈣衍生物粉末含有被吸附到所述 粉末的表面上的至少部分過量的銀反應(yīng)物。51. 治療需要外科植入物的患者的方法，所述方法包括對所述患者進行手術(shù)，將包含權(quán) 利要求1至20中任一項所述的涂層的醫(yī)用植入物插入所述手術(shù)部位中，以及手術(shù)之后將所 述植入物留在原位，其中所述植入物降低在植入物部位的術(shù)后感染的風險或者消除在植入 物部位的術(shù)后感染。
【文檔編號】A61L27/30GK105963781SQ201610390410
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2009年2月27日
【發(fā)明人】L.甘, M.L.斯科特, S.C.賈尼
【申請人】史密夫和內(nèi)修有限公司