一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生菌的培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生菌是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，普遍存在于高等植物中，木本、草本植物、單子葉植物和雙子葉植物內(nèi)均有內(nèi)生細(xì)菌，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。
[0003]植物內(nèi)生菌是一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物豐富、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物。近年來(lái)，植物內(nèi)生菌由于能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，在自然界中具有重要的生態(tài)學(xué)作用，引起了人們廣泛的關(guān)注并取得很大進(jìn)展，從微生物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，是新農(nóng)藥研制的重要途徑。內(nèi)生菌作為微生物中的重要類(lèi)群，其物種豐富，數(shù)量龐大，這為新農(nóng)藥的研究和開(kāi)發(fā)提供了巨大的資源庫(kù)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中開(kāi)始利用植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)白木香樹(shù)結(jié)香，眾所周知，沉香樹(shù)在自然界中因遭受雷擊、風(fēng)折、蟲(chóng)害感染或人畜為害等各種傷害，自身會(huì)分泌樹(shù)脂以修補(bǔ)受傷部位，但某些由于真菌感染受傷的部位很難完成真正意義上的愈合，因此開(kāi)啟了為治愈創(chuàng)傷持久的奇妙的沉香制造與累積過(guò)程，甚至要經(jīng)過(guò)數(shù)百年漫長(zhǎng)歲月的洗禮，才能誕生珍稀優(yōu)質(zhì)的沉香，沉香的稀有也促使了人工生產(chǎn)沉香的發(fā)展，利用植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)白木香樹(shù)結(jié)香，結(jié)香的速度快、所產(chǎn)沉香的質(zhì)量好，所以對(duì)植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)顯的尤為重要，但是現(xiàn)有的植物內(nèi)生菌的液體種在培養(yǎng)時(shí)針對(duì)性差，存在培養(yǎng)成本高、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)和培養(yǎng)出來(lái)的生菌存活率低等缺陷，而且一般培養(yǎng)植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)基的組分也不是純天然的，會(huì)添加一些化學(xué)物質(zhì)，由于在利用生菌誘導(dǎo)白木香樹(shù)產(chǎn)香時(shí)是要將生菌寄生到白木香樹(shù)內(nèi)，這樣利用含有化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的生菌對(duì)白木香樹(shù)結(jié)香具有一定的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服以上技術(shù)缺陷，提供一種生菌存活率高、生菌生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低、純天然的一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法，它包括如下步驟:
[0007](1)培養(yǎng)液的制作
[0008]液體種培養(yǎng)基配方:馬鈴薯70 %，木肩17 %、麩皮5 %、玉米粉4 %、黃豆粉1 %、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二輕鉀0.2%、硫酸鎂0.2%、維生素0.1% ;
[0009]按上述配方把原材料稱(chēng)好后，先把馬鈴薯切薄片置于干凈的不銹鋼鍋中，加木肩，麩皮，玉米粉，黃豆粉加水煮沸，煮至馬鈴薯熟透而不爛為宜，用400目以上濾網(wǎng)過(guò)濾，濾出原液加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸二輕鉀、硫酸鎂、維生素，再加入原培養(yǎng)基配方總重量的12-15倍的潔凈水調(diào)勻，再把培養(yǎng)液裝入培養(yǎng)瓶中；
[0010](2)滅菌處理
[0011]把液體種培養(yǎng)中需要應(yīng)用到的工具，如需要更換的膠頭、氣管、氣接頭、氣源活性碳濾芯，把需要滅菌的工具裝入專(zhuān)用聚丙稀袋中，與液體種培養(yǎng)瓶一并放入滅菌鍋中高壓滅菌；
[0012](3)移入接種室
[0013]液體種培養(yǎng)瓶滅菌冷卻后，移入無(wú)菌室或接種箱，準(zhǔn)備好一系列工具，利用巴斯消毒或紫外線(xiàn)燈照射半小時(shí)后，工作人員更換工作服進(jìn)入接種室接種；
[0014](4)接種
[0015]在接種箱或接種室的無(wú)菌環(huán)境下，把原種瓶瓶口與培養(yǎng)瓶瓶口，用75度酒精擦拭，在過(guò)酒精燈火焰燒過(guò)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口，把內(nèi)生菌液體種原種倒入培養(yǎng)瓶當(dāng)中，更換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)專(zhuān)用膠頭，連接好培養(yǎng)瓶相關(guān)氣接頭，接種完成；
[0016](5)氣調(diào)處理
[0017]培養(yǎng)瓶接好種后移入培養(yǎng)室，打開(kāi)空氣壓縮機(jī)，使其空轉(zhuǎn)排氣5-10分鐘，再連接培養(yǎng)瓶之前，培養(yǎng)氣體經(jīng)過(guò)滅過(guò)菌的活性碳濾芯，把氣體調(diào)壓到適當(dāng)壓力，把無(wú)菌氣體送到培養(yǎng)瓶當(dāng)中，同時(shí)打開(kāi)膠頭上用棉花塞住的排氣閥，使其形成正壓，來(lái)防止雜菌進(jìn)入瓶中污染，在外圍需要連接氣接頭時(shí)，必須用75度酒精擦拭，在酒精燈火焰上方完成連接；
[0018](6)內(nèi)生菌的生長(zhǎng)
[0019]在常溫20度左右，經(jīng)過(guò)3-5天的氣調(diào)培養(yǎng)，內(nèi)生菌液體種完成培養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)整套設(shè)備投資額度少，步驟簡(jiǎn)單、容易操作，所培養(yǎng)的內(nèi)生菌存活率高、生菌生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低，本發(fā)明中的液體培養(yǎng)基采用的是純天然、無(wú)污染的材料，使內(nèi)生菌培養(yǎng)出來(lái)對(duì)后續(xù)的使用具有更好的效果。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是本發(fā)明一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法的培養(yǎng)瓶的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖2是本發(fā)明一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法的內(nèi)生菌菌種在培養(yǎng)狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖3是本發(fā)明一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法的內(nèi)生菌菌種在導(dǎo)出狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]圖4是本發(fā)明一種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法的多瓶一起培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]如圖所示:1、培養(yǎng)瓶，2、空氣輸入口，3、膠頭，4、排氣口，5、菌種壓力輸入口，6、導(dǎo)氣管，7、培養(yǎng)液，8、氣泡，9、1號(hào)培養(yǎng)瓶，10、2號(hào)培養(yǎng)瓶，11、3號(hào)培養(yǎng)瓶，12、4號(hào)培養(yǎng)瓶，13、5號(hào)培養(yǎng)瓶，14、6號(hào)培養(yǎng)瓶，15、連通器，16、管道滅菌輸入端口，17、培養(yǎng)氣體輸入端口，18、壓力氣體輸入端口，19、液體菌種輸入端口，20、閥門(mén)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]現(xiàn)有技術(shù)中用植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)白木香樹(shù)結(jié)香的菌種主要包括以下菌種:假單胞菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、土壤桿菌屬、泛菌屬、甲基桿菌屬、鏈霉菌屬、鏈輪絲菌屬、游動(dòng)放線(xiàn)菌屬、諾氏卡菌屬、小單胞菌等，利用植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)白木香樹(shù)結(jié)香，結(jié)香的速度快、所產(chǎn)沉香的質(zhì)量好，便于推廣，在具體實(shí)施時(shí)，利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法將液體種培養(yǎng)好之后，然后用接種機(jī)將液體種導(dǎo)入白木香樹(shù)內(nèi)。
[0027]實(shí)施例一
[0028]—種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法，其特征在于:它包括如下步驟:
[0029](1)培養(yǎng)液的制作
[0030]液體種培養(yǎng)基配方:馬鈴薯70%，木肩17%、麩皮5%、玉米粉4%、黃豆粉1%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二輕鉀0.2%、硫酸鎂0.2%、維生素0.1% ;
[0031]按上述配方把原材料稱(chēng)好后，先把馬鈴薯切薄片置于干凈的不銹鋼鍋中，加木肩，麩皮，玉米粉，黃豆粉加水煮沸，煮至馬鈴薯熟透而不爛為宜，用500目的濾網(wǎng)過(guò)濾，濾出原液加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸二輕鉀、硫酸鎂、維生素，再加入原培養(yǎng)基配方總重量的12倍的潔凈水調(diào)勻，再把培養(yǎng)液裝入培養(yǎng)瓶中；
[0032](2)滅菌處理
[0033]把液體種培養(yǎng)中需要應(yīng)用到的工具，如需要更換的膠頭、氣管、氣接頭、氣源活性碳濾芯，把需要滅菌的工具裝入專(zhuān)用聚丙稀袋中，與液體種培養(yǎng)瓶一并放入滅菌鍋中高壓滅菌；
[0034](3)移入接種室
[0035]液體種培養(yǎng)瓶滅菌冷卻后，移入無(wú)菌室，準(zhǔn)備好一系列工具，利用紫外線(xiàn)燈照射半小時(shí)后，工作人員更換工作服進(jìn)入接種室接種；
[0036](4)接種
[0037]在接種箱或接種室的無(wú)菌環(huán)境下，把原種瓶瓶口與培養(yǎng)瓶瓶口，用75度酒精擦拭，在過(guò)酒精燈火焰燒過(guò)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口，把內(nèi)生菌液體種原種倒入培養(yǎng)瓶當(dāng)中，更換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)專(zhuān)用膠頭，連接好培養(yǎng)瓶相關(guān)氣接頭，接種完成；
[0038](5)氣調(diào)處理
[0039]培養(yǎng)瓶接好種后移入培養(yǎng)室，打開(kāi)空氣壓縮機(jī)，使其空轉(zhuǎn)排氣5分鐘，再連接培養(yǎng)瓶之前，培養(yǎng)氣體經(jīng)過(guò)滅過(guò)菌的活性碳濾芯，把氣體調(diào)壓到適當(dāng)壓力，把無(wú)菌氣體送到培養(yǎng)瓶當(dāng)中，同時(shí)打開(kāi)膠頭上用棉花塞住的排氣閥，使其形成正壓，來(lái)防止雜菌進(jìn)入瓶中污染，在外圍需要連接氣接頭時(shí)，必須用75度酒精擦拭，在酒精燈火焰上方完成連接；
[0040](6)內(nèi)生菌的生長(zhǎng)
[0041]在常溫20度左右，經(jīng)過(guò)3天的氣調(diào)培養(yǎng)，內(nèi)生菌液體種完成培養(yǎng)。
[0042]實(shí)施例二
[0043]—種用于誘導(dǎo)沉香結(jié)香的內(nèi)生菌液體種的培養(yǎng)方法，其特征在于:它包括如下步驟:
[0044](1)培養(yǎng)液的制作
[0045]液體種培養(yǎng)基配方:馬鈴薯70 %，木肩17 %、麩皮5 %、玉米粉4 %、黃豆粉1 %、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二輕鉀0.2%、硫酸鎂0.2%、維生素0.1% ;
[0046]按上述配方把原材料稱(chēng)好后，先