一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地說設(shè)及一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 培養(yǎng)基是提供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的 多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物，為獲得高品質(zhì)、高濃度的生物制品，必須要有營(yíng)養(yǎng)豐富完備、組成 合理、質(zhì)量穩(wěn)定，能充分發(fā)揮生產(chǎn)菌種合成代謝產(chǎn)物的能力。
[0003] 副雞禽桿菌的生命特性比較脆弱，是一類酶系統(tǒng)不完全的革蘭氏陰性桿菌，生長(zhǎng) 不僅需要豐富的碳源和氮源，還需要健康動(dòng)物血清、酵母浸出液及輔酶等特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而 且培養(yǎng)條件苛刻，給菌液的發(fā)酵培養(yǎng)帶來困難，目前副雞禽桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)所獲得活菌數(shù) 不高，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方 法。 陽(yáng)〇化]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0006] 一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：（1) 一級(jí)種子液的制備；（2)二 級(jí)種子液的制備；（3)微生物發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)；其特征在于，所述的二級(jí)種子液為副雞禽桿 菌WF株或YC株二級(jí)種子液，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)后各菌株活菌數(shù)均> 4. 5Xl〇9CFU/mL。
[0007] 進(jìn)一步地，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)中副雞禽桿菌二級(jí)種子液接入量為5% (V/V)。
[0008] 進(jìn)一步地，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基。
[0009] 進(jìn)一步地，所述的半合成培養(yǎng)基的抑值為7. 2~7. 6。
[0010] 進(jìn)一步地，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)為通氣培養(yǎng)，通氣量為5~6L/分鐘。
[0011] 進(jìn)一步地，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)條件為攬拌速度100~200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為37°C， 培養(yǎng)時(shí)間為16-1化。
[0012] 本發(fā)明的有益效果在于：該培養(yǎng)工藝所獲得菌株活菌數(shù)高，且生產(chǎn)周期短，對(duì)疫苗 的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝有很大的提高和改善。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施，有必要在此指出的是，W下實(shí)施只是用于本發(fā) 明的進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本

【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 菌種：副雞禽桿菌WF株和YC株，由山東華宏生物工程有限公司提供。
[0015] 培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基，由山東華宏生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室自制。
[0016] 發(fā)酵罐：4化微生物發(fā)酵罐，購(gòu)自上海高機(jī)生物工程有限公司。
[0017] 實(shí)施例1二級(jí)種子液的制備
[0018] 將副雞禽桿菌WF株或YC株的一級(jí)種子劃線接種于雞肉湯瓊脂平板，在含5%~ 10% %的條件下，37°C培養(yǎng)16~1她，選巧光性強(qiáng)的典型菌落接種于雞肉湯培養(yǎng)基中，置 37°C培養(yǎng)16~20h，經(jīng)純檢合格后，即為二級(jí)種子，在2~8°C保存，不得超過6~化。
[0019] 實(shí)施例2二級(jí)種子接種量對(duì)制苗菌液濃度的影響
[0020] 半合成培養(yǎng)基中，分別按1%、2%、3%、5%的接種量（￥八）接種副雞禽桿菌￥尸株 或YC株的二級(jí)種子液，37°C培養(yǎng)20h，分別對(duì)不同時(shí)間段的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較二級(jí)種 子不同接種量對(duì)制苗菌液濃度的影響。 陽(yáng)02U 不同二級(jí)種子接種量對(duì)副雞禽桿菌WF株或YC株菌液培養(yǎng)濃度有一定影響，詳細(xì) 結(jié)果見表1和表2。
[0022] 表1不同二級(jí)種子接種量對(duì)WF株菌液濃度的影響
[0024] 表2不同二級(jí)種子接種量對(duì)YC株菌液濃度的影響
[0026] 由表1和表2可知，在培養(yǎng)基中接種5%含量的二級(jí)種子，可W在較短時(shí)間內(nèi)獲 得較好的培養(yǎng)效果，生產(chǎn)周期和生產(chǎn)工藝考慮，選擇5%接種量為適宜接種量，培養(yǎng)時(shí)間為 16-1 化。
[0027] 實(shí)施例3不同培養(yǎng)方式對(duì)制苗菌液濃度的影響
[0028] 分別W靜置培養(yǎng)及通氣培養(yǎng)方式，測(cè)定不同菌液培養(yǎng)方式對(duì)菌液濃度的影響。通 氣培養(yǎng)時(shí)開始小量通氣，逐漸增大通氣量，通氣量控制在5~6L/分鐘，37°C條件下培養(yǎng) 1她，分別對(duì)12h、1化和1她的時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較不同菌液培養(yǎng)方式對(duì)菌液濃 度的影響。
[0029] 靜置培養(yǎng)與通氣培養(yǎng)對(duì)WF株或YC株培養(yǎng)菌液活菌計(jì)數(shù)存在較大影響，詳細(xì)結(jié)果 見表3。
[0030] 表3靜置培養(yǎng)與通氣培養(yǎng)的培養(yǎng)菌液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（Xl〇9cFU/mL)
[0031]
[0032] 副雞禽桿菌在培養(yǎng)增殖過程中，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物富集，抑制菌體的生長(zhǎng)增殖，通氣 培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中不斷輸入新鮮空氣，調(diào)整培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、均勻度及抑值，因此對(duì)副 雞禽桿菌進(jìn)行通氣培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是明顯的。
[0033] 實(shí)施例4微生物發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)條件的優(yōu)化
[0034] 按發(fā)酵罐最小裝量加入半合成培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基總量的5% (V/V)加入副雞禽桿 菌WF株或YC株的二級(jí)種子液，進(jìn)行微生物發(fā)酵罐單獨(dú)擴(kuò)大培養(yǎng)，溫度控制在37°C，調(diào)節(jié)攬 拌轉(zhuǎn)速、抑值、通氣量，培養(yǎng)1她，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，比較不同培養(yǎng)條件下副雞禽桿菌的菌液濃 度。
[0035] ①不同攬拌速度對(duì)菌液濃度影響的試驗(yàn)結(jié)果
[0036] 在利用微生物發(fā)酵罐培養(yǎng)副雞禽桿菌WF株或YC株的過程中，攬拌速度可顯著增 加菌液的濃度，但副雞禽桿菌較脆弱，過高的攬拌速度可影響其生長(zhǎng)增殖，因此綜合各種因 素，我們將微生物發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，攬拌速度控制為100~200轉(zhuǎn)/分鐘，詳細(xì)結(jié)果見表4。
[0037] 表4微生物發(fā)酵罐不同攬拌速度對(duì)菌液終濃度的影響（XlO9CFlVmL)
[0039] ②不同通氣量對(duì)菌液濃度影響的試驗(yàn)結(jié)果
[0040] 在微生物發(fā)酵罐培養(yǎng)副雞禽桿菌WF株或YC株的過程中，不斷輸入新鮮空氣，并排 除細(xì)菌產(chǎn)生的氣體，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的均勻度及抑值，對(duì)細(xì)菌濃度影響較大，通 過試驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為5~6L/分鐘的通氣量較好，詳細(xì)結(jié)果見表5。
[0041] 表5不同通氣量對(duì)菌液終濃度的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：（1) 一級(jí)種子液的制備；（2)二級(jí) 種子液的制備；（3)微生物發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)；其特征在于，所述的二級(jí)種子液為副雞禽桿菌 WF株或YC株二級(jí)種子液，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)后各菌株活菌數(shù)均多4. 5X109CFU/mL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大 培養(yǎng)中副雞禽桿菌二級(jí)種子液接入量為5 % (V/V)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大 培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的半合 成培養(yǎng)基的pH值為7. 2~7. 6。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大 培養(yǎng)為通氣培養(yǎng)，通氣量為5~6L/分鐘。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的擴(kuò)大 培養(yǎng)條件為攪拌速度1〇〇~200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-18h。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種副雞禽桿菌菌液的培養(yǎng)方法，屬于發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域，其培養(yǎng)步驟：(1)一級(jí)種子液的制備；(2)二級(jí)種子液的制備；(3)微生物發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)；其中，所述的二級(jí)種子液為副雞禽桿菌WF株或YC株二級(jí)種子液，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)后各菌株活菌數(shù)均≥4.5×109CFU/ml。本發(fā)明所獲得各菌株活菌數(shù)高，培養(yǎng)周期短，為副雞禽桿菌規(guī)?；a(chǎn)合格菌液提供了良好的工藝基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝有很大的提高和改善。
【IPC分類】C12N1/20
【公開號(hào)】CN105296407
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510896740
【發(fā)明人】王永明, 朱萬光, 王曉麗, 張效偉, 于海光, 牛衛(wèi)衛(wèi), 趙飛飛, 李士成
【申請(qǐng)人】山東華宏生物工程有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日