專利名稱：禽霍亂外膜蛋白a基因疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌疾病疫苗的制備方法，具體的說(shuō)是禽霍亂外膜蛋白A基因疫 苗的制備方法。
背景技術(shù)：
禽霍亂也稱為禽多殺性巴氏桿菌病，是由禽霍亂菌(又稱為禽多殺性巴氏桿菌)弓丨 起的一種家禽的接觸性傳染病，在我國(guó)是常見的多發(fā)性傳染病，而且在世界各國(guó)均有分布， 幾乎所有的家禽都能感染該病，其傳染流行嚴(yán)重影響家禽業(yè)的健康發(fā)展，給家禽業(yè)帶來(lái)了 巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國(guó)對(duì)于禽霍亂的控制主要采用抗生素藥物治療，但藥物治療存在一定的缺 點(diǎn)，停藥后容易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)對(duì)禽體產(chǎn)生明顯的毒害作用，引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率下 降，而且長(zhǎng)期或者反復(fù)用藥容易導(dǎo)致禽霍亂菌產(chǎn)生耐藥性。目前對(duì)于禽霍亂的預(yù)防措施主要采用的是疫苗注射，常用的疫苗包括弱毒活疫苗 和滅活疫苗兩種，但兩種疫苗的免疫效果并不是特別理想，弱毒活疫苗的免疫持續(xù)期不夠 長(zhǎng)，免疫保護(hù)力不夠高，而且給家禽注射后具有一定的副作用，甚至可能會(huì)造成一些死亡。 滅活疫苗存在保護(hù)率低和免疫期短的問(wèn)題，比弱毒活疫苗更為嚴(yán)重，因此滅活疫苗的免疫 效果尚不及弱毒活疫苗。外膜蛋白A基因是禽霍亂菌主要的保護(hù)性抗原之一，進(jìn)入機(jī)體后可誘導(dǎo)機(jī)體的免 疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答，為機(jī)體提供抗禽霍亂感染的保護(hù)力，因此，用禽霍亂菌外膜蛋 白A基因可制備相應(yīng)的疫苗用以預(yù)防禽霍亂。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種可用于預(yù)防禽霍亂的禽霍亂外膜蛋白A基因 疫苗的制備方法，通過(guò)該方法制備出的疫苗，具有制備簡(jiǎn)單，操作方便的優(yōu)點(diǎn)，制得的產(chǎn)品 能有效的防止禽霍亂對(duì)雞的傷害。本發(fā)明為解決上述問(wèn)題，提供的技術(shù)方案為 步驟一、引物設(shè)計(jì)
根據(jù)禽霍亂菌基因組序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和
P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'； P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ； 步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴(kuò)增及純化
1)在0. 2ml的PCR反應(yīng)管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩沖液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程 序首先進(jìn)行94°C預(yù)變性，時(shí)間為5分鐘，預(yù)變性結(jié)束后進(jìn)入循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?4° C變性，時(shí)間為1分鐘，57° C復(fù)性，時(shí)間為45秒鐘，72° C延伸，時(shí)間為1分鐘，將上述循環(huán) 程序重復(fù)30次，30次循環(huán)結(jié)束后，72°C再次延伸，時(shí)間10分鐘，得到PCR擴(kuò)增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察 到目的基因后，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管a并稱其重量，然后 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物切下來(lái)，將切下來(lái)的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重并計(jì)算出 從凝膠上切下來(lái)的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物的重量，然后將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質(zhì)完全融解止，將融解后的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位于收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放在離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，再向收集管a內(nèi)的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，后向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，將收集管a在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置于1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；
步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. I+的酶切及純化
1)酶切體系的配制在1.5ml的離心管c中加入真核表達(dá)載體pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性內(nèi)切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應(yīng)8小時(shí)，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測(cè)
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合物Α，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管d并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d 中，稱取離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的混合物A的重量，然后將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離 心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi) 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離 心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，倒掉收集管b中的液體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml的離心管e中，后在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切并純化后的真核表達(dá)載體PCDNA3. 1+，備用；
步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的制備
1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內(nèi) 切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應(yīng)5小時(shí)，取出備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；
3.按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1. 5ml的離心管g并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重并計(jì)算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然后將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒 掉收集管c內(nèi)的液體，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分 鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中， 轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，倒掉收集管c中的液 體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c并放置于1. 5ml 的離心管h中，后在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中 的40μ1液體，該液體就是酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；
4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1+2μ1、DNA連接酶 μ 、DNA連接酶緩沖液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應(yīng)12小時(shí)，備用；
5)待反應(yīng)結(jié)束后，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置于0°C 的冰水混合物中，時(shí)間30分鐘，取出置于42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養(yǎng)基，形成含有 LB液體培養(yǎng)基的混合液，備用；
6)將離心管i置于37°C的搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為1.5小時(shí)，結(jié) 束后，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養(yǎng)基的混合液涂布于含濃度為5(^g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備 用；
7)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入5ml含氨芐青霉素的 的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為50μβ/πι1，后將含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 置于37° C恒溫?fù)u床內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；
8)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，取Iml含有菌落的LB液體培養(yǎng)液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預(yù)先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后將離心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管j中加入150μ1的 預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，后將離心管j放于0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘，取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，后取出，備 用；
9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻后，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無(wú)水乙醇，將離心管m于-20° C條件下，放置20分鐘，后取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；
10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉淀物I，該沉淀物I為pCA質(zhì)粒，待 PCA質(zhì)粒干燥后，加入30μ1超純水進(jìn)行溶解，得到的溶液為pCA質(zhì)粒溶液；
11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質(zhì)粒溶液，后依次向離心管η中加入 μ 的限制性內(nèi)切酶Kpn I、 μ1的限制性內(nèi)切酶EcoR I、 μ 的限制性內(nèi)切酶緩沖液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C條件下，反應(yīng)2小時(shí)，形成酶切液；
12)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pCA質(zhì)粒酶，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，觀察到1050bp 大小的條帶，PCA質(zhì)粒是本發(fā)明制備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；
步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質(zhì)粒的大量制備
1)挑取步驟四中含有PCA質(zhì)粒的大腸桿菌JM83；
2)挑取培養(yǎng)后LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入25ml含氨芐青霉素的的 LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為5(^g/ml，后將LB液體培養(yǎng)基，置于37°C恒溫?fù)u 床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，至液體在600納米處的吸光度，OD600值為0. 6止，將振 蕩培養(yǎng)后的液體轉(zhuǎn)至500ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為 5(^g/ml，置于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)15小時(shí)；
3)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，將含有菌落的500mlLB液體培養(yǎng)基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心時(shí)間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉淀物II，向離心管中加入18ml的預(yù)先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 淀物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將IOOOml的離心管置于20° C條件下，放置5分鐘，后向IOOOml的離心管中加 入20ml預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放于0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；
4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻后在20° C條件下放置10分鐘，后放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結(jié)束后倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉淀物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉淀物III干燥后備用；
5)在含有沉淀物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.O的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物III溶解，將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分鐘，后向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間10分鐘，取上層澄清液體，備用；6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 于20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物IV，干燥，備用；
7)向含有沉淀物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，將沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉(zhuǎn)至5ml的離心管內(nèi)，加入Iml 的無(wú)水乙醇，置于-20° C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉淀物V，干燥備用；
8)向含有沉淀物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂，PEG-MgCl2溶液，置于20° C條件下，放置30分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物VI，該沉淀物就是 大量制備的PCA質(zhì)粒即大量制備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；
9)向含有沉淀物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液為大量制備的PCA質(zhì)粒溶液，后用分光光度計(jì)測(cè)定溶液中所 含的PCA質(zhì)粒的濃度，備用；
10)對(duì)禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng) 中觀察到條帶為1050bp時(shí)，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗制備成功。本發(fā)明涉及到以下菌種和試劑
禽霍亂菌Uria/ PasteMrella)購(gòu)買自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，見生物材料保
藏證明附件1、附件2、附件4;
大腸桿菌(Escherichia, coli /AK )購(gòu)買自華美生物工程有限公司，見生物材料 保藏證明附件3;
DNA凝膠回收試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供，該試劑盒中自配有成品的溶液I、 溶液II和溶液III。有益效果
本發(fā)明提供了一種禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的制備方法，該方法制備簡(jiǎn)單，容易操作。本發(fā)明所用的真核載體為PCDNA3. 1(+)，該載體具有合適的多克隆位點(diǎn)，有高效能 穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物及人類細(xì)胞的能力，具有高效率CMV立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、 T7啟動(dòng)子、BGH多腺苷酸信號(hào)、SV40早期啟動(dòng)子等，有利于外源基因的表達(dá)，同時(shí)該載體含 有氨芐青霉素抗性基因(AmpD，可用作篩選標(biāo)記，該基因中還含有免疫增強(qiáng)CpG DNA序列， 可增強(qiáng)疫苗的免疫效果。
具體實(shí)施例方式步驟一、引物設(shè)計(jì)
根據(jù)禽霍亂菌基因組序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；
P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ；
步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴(kuò)增及純化
1)在0.2ml的PCR反應(yīng)管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩沖液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程 序首先進(jìn)行94°C預(yù)變性，時(shí)間為5分鐘，預(yù)變性結(jié)束后進(jìn)入循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?94° C變性，時(shí)間為1分鐘，57° C復(fù)性，時(shí)間為45秒鐘，72° C延伸，時(shí)間為1分鐘，將上述循環(huán) 程序重復(fù)30次，30次循環(huán)結(jié)束后，72°C再次延伸，時(shí)間10分鐘，得到PCR擴(kuò)增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物，備用；
2)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩沖液中并在微波爐內(nèi)煮沸使瓊脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入制膠板中，插入制膠梳， 凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩沖 液中，將禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物加入到凝膠的點(diǎn)樣孔中，打開電泳儀開關(guān)，在電泳 儀電壓為120伏特時(shí)開始電泳，電泳20分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到目的 基因后，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管a并稱其重量，然后 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物切下來(lái)，將切下來(lái)的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重并計(jì)算出 從凝膠上切下來(lái)的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物的重量，然后將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質(zhì)完全融解止，將融解后的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位于收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放在離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，再向收集管a內(nèi)的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，后向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，將收集管a在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置于1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；
步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. 1(+)的酶切及純化
1)酶切體系的配制在1.5ml的離心管c中加入真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+) 10μ1、限 制性內(nèi)切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水29μ1，混 合均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應(yīng)8小時(shí)，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測(cè)
稱取1. 0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩沖液中并在微波爐內(nèi)煮沸使瓊脂糖 粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩沖液 中，將混合物A加入到凝膠的點(diǎn)樣孔中，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為120伏特時(shí)開始 電泳，電泳20分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1. 5ml的離心管d并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d 中，稱取離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的混合物A的重量，然后將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離 心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi) 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離 心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，倒掉收集管b中的液體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml的離心管e中，后在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切并純 化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)，備用；
步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的制備
1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內(nèi) 切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水24μ1，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應(yīng)5小時(shí)，取出備用；
2)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩沖液中并在微波爐內(nèi)煮沸使瓊脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入制膠板中，插入制膠梳， 凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩沖 液中，將混合物B加入到凝膠的點(diǎn)樣孔中，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為120伏特時(shí)開 始電泳，電泳20分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管g并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重并計(jì)算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然后將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒 掉收集管c內(nèi)的液體，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分 鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中， 轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，倒掉收集管c中的液 體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c并放置于1. 5ml 的離心管h中，后在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中的40μ1液體，該液體就是酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；
4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+) 2μ1、 ΝΑ連接酶 μ1、 ΝΑ連接酶緩沖液2μ1和 水5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應(yīng)12小時(shí)，備用；
5)待反應(yīng)結(jié)束后，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置于0°C 的冰水混合物中，時(shí)間30分鐘，取出置于42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養(yǎng)基，形成含有 LB液體培養(yǎng)基的混合液，備用；
6)將離心管i置于37°C的搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為1.5小時(shí)，結(jié) 束后，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養(yǎng)基的混合液涂布于含濃度為5(^g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37° C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備 用；
7)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入5ml含氨芐青霉素的 的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為50μβ/πι1，后將含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 置于37° C恒溫?fù)u床內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；
8)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，取Iml含有菌落的LB液體培養(yǎng)液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預(yù)先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后將離心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管j中加入150μ1的 預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，后將離心管j放于0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘， 取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，后取出，備 用；
9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻后，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無(wú)水乙醇，將離心管m于-20° C條件下，放置20分鐘，后取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；
10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉淀物I，該沉淀物I為pCA質(zhì)粒，待 PCA質(zhì)粒干燥后，加入30μ1超純水進(jìn)行溶解，得到的溶液為pCA質(zhì)粒溶液；
11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質(zhì)粒溶液，后依次向離心管η中加入 μ 的限制性內(nèi)切酶Kpn I、 μ1的限制性內(nèi)切酶EcoR I、 μ 的限制性內(nèi)切酶緩沖液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C條件下，反應(yīng)2小時(shí)，形成酶切液；
12)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到100ml的1倍電泳緩沖液中并在微波爐內(nèi)煮沸使 瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，后倒入制膠板中，插入制 膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔；將凝膠放入1倍電 泳緩沖液中，將PCA質(zhì)粒酶切液加入到凝膠的點(diǎn)樣孔中，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓 為120伏特時(shí)開始電泳，電泳20分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，觀察到 1050bp大小的條帶，證明該pCA質(zhì)粒是本發(fā)明制備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質(zhì)粒的大量制備
1)挑取步驟四中含有PCA質(zhì)粒的大腸桿菌JM83；
2)挑取培養(yǎng)后LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入25ml含氨芐青霉素的的 LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為5(^g/ml，后將LB液體培養(yǎng)基，置于37°C恒溫?fù)u 床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，至液體在600納米處的吸光度(0D_值)為0. 6止，將振 蕩培養(yǎng)后的液體轉(zhuǎn)至500ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為 5(^g/ml，置于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)15小時(shí)；
3)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，將含有菌落的500mlLB液體培養(yǎng)基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心時(shí)間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉淀物II，向離心管中加入18ml的預(yù)先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 淀物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將IOOOml的離心管置于20° C條件下，放置5分鐘，后向IOOOml的離心管中加 入20ml預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放于0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；
4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻后在20° C條件下放置10分鐘，后放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結(jié)束后倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉淀物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉淀物III干燥后備用；
5)在含有沉淀物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.O的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸(TE)溶液，使沉淀物III溶解，將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，在0° C的 冰水混合物中，放置10分鐘，后向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間10分鐘，取上層澄清液體，備用；
6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 于20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物IV，干燥，備用；
7)向含有沉淀物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶液，將沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉(zhuǎn)至5ml的離心管內(nèi)，加入Iml 的無(wú)水乙醇，置于-20°C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉淀物V，干燥備用；
8)向含有沉淀物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂(PEG-MgCl2)溶液，置于20°C條件下，放置30分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物VI，該沉淀物就是 大量制備的PCA質(zhì)粒即大量制備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉淀物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液為大量制備的PCA質(zhì)粒溶液，后用分光光度計(jì)測(cè)定溶液中所 含的PCA質(zhì)粒的濃度，備用；
10)對(duì)禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng) 中觀察到條帶為1050bp時(shí)，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗制備成功；
步驟六、動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
取1日齡的沒經(jīng)過(guò)免疫的雛雞40只，每日按正常日糧飼養(yǎng)，4周齡時(shí)將其平均分為試 驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，試驗(yàn)組共三次免疫，第一次免疫時(shí)間為4周齡，第二次免疫時(shí)間 為6周齡，第三次免疫時(shí)間為8周齡，注射提取的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗即pCA質(zhì)粒， 每次免疫的劑量200μβ/只，采用大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射；對(duì)照組的20只雞不進(jìn)行任何免疫； 步驟七、動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)
10周齡時(shí)，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行肌肉注射禽霍亂菌，攻毒劑量為每只雞注射IXlO9 個(gè)禽霍亂菌，攻毒之后，對(duì)兩組繼續(xù)飼養(yǎng)至12周齡時(shí)止，記錄兩組在12周齡時(shí)的存活量，并 計(jì)算出試驗(yàn)組和對(duì)照組的保護(hù)率，保護(hù)率越高說(shuō)明免疫預(yù)防效果越好； 試驗(yàn)組的保護(hù)率的計(jì)算方法如下 (試驗(yàn)組在12周齡時(shí)存活量+20) X 100% 對(duì)照組的保護(hù)率的計(jì)算方法如下 (對(duì)照組在12周齡時(shí)存活量+20) X 100%
結(jié)果顯示，試驗(yàn)組在12周齡時(shí)存活13只，試驗(yàn)組的保護(hù)率為65% ；對(duì)照組在12周齡全 部死亡，對(duì)照組的保護(hù)率為0%，說(shuō)明利用本發(fā)明制備出的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗pCA給 雞進(jìn)行三次免疫之后能使被免疫雞有效地預(yù)防禽霍亂。所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成分為按重量比每升LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有 1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉和水。所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分為按重量比每升LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰 蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水。所述的溶液I的組成成分為按質(zhì)量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量為水。所述的溶液II的組成成分為按重量比每升溶液II中含有l(wèi)Ommol/L的氫氧化鈉、 10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水。所述的溶液III的組成成分為按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸 鉀、11. 5%的冰醋酸，余量為水。所述的磷酸鹽緩沖液的組成成分為按重量比每升磷酸鹽緩沖液中含有0. 8%的氯 化鈉、0. 02%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 29%的十二水合磷酸氫二鈉，余量為水。
權(quán)利要求
1. 一種禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗的制備方法，其特征在于步驟一、引物設(shè)計(jì)根據(jù)禽霍亂菌基因組序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和P2 Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ；步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴(kuò)增及純化1)在0.2ml的PCR反應(yīng)管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩沖液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程 序首先進(jìn)行94°C預(yù)變性，時(shí)間為5分鐘，預(yù)變性結(jié)束后進(jìn)入循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?94° C變性，時(shí)間為1分鐘，57° C復(fù)性，時(shí)間為45秒鐘，72° C延伸，時(shí)間為1分鐘，將上述循環(huán) 程序重復(fù)30次，30次循環(huán)結(jié)束后，72°C再次延伸，時(shí)間10分鐘，得到PCR擴(kuò)增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察 到目的基因后，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管a并稱其重量，然后 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物切下來(lái)，將切下來(lái)的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重并計(jì)算出 從凝膠上切下來(lái)的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產(chǎn)物的重量，然后將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產(chǎn)物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質(zhì)完全融解止，將融解后的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位于收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放在離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，再向收集管a內(nèi)的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，后向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內(nèi)的液體，將收集管a在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置于1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；步驟三、真核表達(dá)載體pcDNA3. I+的酶切及純化1)酶切體系的配制在1.5ml的離心管c中加入真核表達(dá)載體pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性內(nèi)切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應(yīng)8小時(shí)，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)混合物A進(jìn)行檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合物Α，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管d并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d中，稱取離心管d的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來(lái)的混合物A的重量，然后將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離 心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi) 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離 心1分鐘，離心后倒掉收集管b內(nèi)的液體，倒掉收集管b中的液體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置于1. 5ml的離心管e中，后在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切并純 化后的真核表達(dá)載體PCDNA3. 1+，備用；步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的制備1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內(nèi) 切酶Kpn I 3μ1、限制性內(nèi)切酶EcoR I 3μ1、限制性內(nèi)切酶緩沖液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應(yīng)5小時(shí)，取出備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進(jìn)行操作取1.5ml的離心管g并稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來(lái)，將切下來(lái)的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重并計(jì)算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然后將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解后的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒 掉收集管c內(nèi)的液體，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分 鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機(jī)中， 轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，離心后倒掉收集管c內(nèi)的液體，倒掉收集管c中的液 體后將放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c并放置于1. 5ml 的離心管h中，后在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鐘，放入離心機(jī)內(nèi)轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中 的40μ1液體，該液體就是酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切并純化后的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并純化后的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1+2μ1、DNA連接酶 μ 、DNA連接酶緩沖液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應(yīng)12小時(shí)，備用；5)待反應(yīng)結(jié)束后，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置于0°C 的冰水混合物中，時(shí)間30分鐘，取出置于42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養(yǎng)基，形成含有 LB液體培養(yǎng)基的混合液，備用；6)將離心管i置于37°C的搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為1.5小時(shí)，結(jié)束后，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養(yǎng)基的混合液涂布于含濃度為5(^g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 固體培養(yǎng)基上，將涂布后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基置于37° C的培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)16小時(shí)，備 用；7)挑取培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入5ml含氨芐青霉素的 的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為50μβ/πι1，后將含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 置于37° C恒溫?fù)u床內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；8)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，取Iml含有菌落的LB液體培養(yǎng)液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預(yù)先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后將離心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，后向離心管j中加入150μ1的 預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，后將離心管j放于0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘， 取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，后取出，備 用；9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻后，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，待離心結(jié)束后取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無(wú)水乙醇，將離心管m于-20° C條件下，放置20分鐘，后取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速13000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉淀物I，該沉淀物I為pCA質(zhì)粒，待 PCA質(zhì)粒干燥后，加入30μ1超純水進(jìn)行溶解，得到的溶液為pCA質(zhì)粒溶液；11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質(zhì)粒溶液，后依次向離心管η中加入 μ 的限制性內(nèi)切酶Kpn I、 μ1的限制性內(nèi)切酶EcoR I、 μ 的限制性內(nèi)切酶緩沖液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C條件下，反應(yīng)2小時(shí)，形成酶切液；12)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pCA質(zhì)粒酶，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察，觀察到1050bp 大小的條帶，PCA質(zhì)粒是本發(fā)明制備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質(zhì)粒的大量制備1)挑取步驟四中含有PCA質(zhì)粒的大腸桿菌JM83；2)挑取培養(yǎng)后LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的1個(gè)菌落，將菌落放入25ml含氨芐青霉素的的 LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為5(^g/ml，后將LB液體培養(yǎng)基，置于37°C恒溫?fù)u 床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，至液體在600納米處的吸光度，OD600值為0. 6止，將振 蕩培養(yǎng)后的液體轉(zhuǎn)至500ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，其氨芐青霉素的濃度為 5(^g/ml，置于37°C恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)15小時(shí)；3)待振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，將含有菌落的500mlLB液體培養(yǎng)基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心時(shí)間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉淀物II，向離心管中加入18ml的預(yù)先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 淀物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將1000ml的離心管置于20° C條件下，放置5分鐘，后向1000ml的離心管中加 入20ml預(yù)先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放于0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘，取出放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻后在20° C條件下放置10分鐘，后放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結(jié)束后倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉淀物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn) 速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉淀物III干燥后備用；5)在含有沉淀物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物III溶解，將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分鐘，后向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間10分鐘，取上層澄清液體，備用；6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 于20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物IV，干燥，備用；7)向含有沉淀物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，將沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉(zhuǎn)至5ml的離心管內(nèi)，加入Iml 的無(wú)水乙醇，置于-20°C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉淀物V，干燥備用；8)向含有沉淀物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂，PEG-MgCl2溶液，置于20° C條件下，放置30分鐘，放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速 13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉淀物VI，該沉淀物就是 大量制備的PCA質(zhì)粒即為制備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉淀物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液為大量制備的PCA質(zhì)粒溶液，后用分光光度計(jì)測(cè)定溶液中所 含的PCA質(zhì)粒的濃度，備用；10)對(duì)禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng) 中觀察到條帶為1050bp時(shí)，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗制備成功；所述的載體為真核表達(dá)載體pcDNA3. I+ ；所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成分為按重量比每升LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1% 的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉和水；所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分為按重量比每升LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白 胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述的溶液I的組成成分為按質(zhì)量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的溶液II的組成成分為按重量比每升溶液II中含有l(wèi)Ommol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的溶液III的組成成分為按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水；所述的磷酸鹽緩沖液的組成成分為按重量比每升磷酸鹽緩沖液中含有0. 8%的氯化 鈉、0. 02%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 29%的十二水合磷酸氫二鈉，余量為水。
全文摘要
一種禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗的制備方法，以禽多殺性巴氏桿菌基因組序列設(shè)計(jì)引物，以禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株基因組為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因，利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)目的基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行酶切，后將目的基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)JM83中，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后獲得禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗；本發(fā)明方法所制備出的禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)表明，可降低禽多殺性巴氏桿菌病的發(fā)生，降低禽多殺性巴氏桿菌對(duì)禽類侵襲，其制作方法簡(jiǎn)單，容易操作。
文檔編號(hào)A61K39/102GK102139116SQ201010605018
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月25日
發(fā)明者孫軍杰, 孫曉菲, 宮強(qiáng), 張勇法, 張敏, 曲寧, 牛明福, 程茗 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)