一種用青蒿生產(chǎn)菌絲霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用青葛生產(chǎn)菌絲霉素的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)是畜牧養(yǎng)殖大國(guó)，每年生產(chǎn)的動(dòng)物飼料在存放過(guò)程中因腐敗變質(zhì)引起的損失 巨大。因此大量生產(chǎn)商在飼料中添加化學(xué)防腐劑，但殘留在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的化學(xué)防腐劑不僅 影響了畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，還威脅到人們的身體健康，如引發(fā)腸胃炎等疾病，影響肝、腎功能 等。另一方面，為了預(yù)防畜牧的疾病，動(dòng)物飼料中長(zhǎng)期大量地添加抗生素，由此引發(fā)的動(dòng)物 消化道素亂、耐藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重。
[0003] 抗菌膚（Antibacterialpeptide,AB巧是動(dòng)物先天性免疫的重要組成部分，抗菌 譜廣，對(duì)細(xì)菌、真菌、分枝桿菌、螺旋體、披膜病毒、支原體、衣原體、螺旋體W及一些惡性細(xì) 胞（如腫瘤細(xì)胞）和艾滋病病毒都具有殺傷作用。由于抗菌膚主要是通過(guò)與細(xì)胞膜上的氨 基酸相互作用，W此穿透細(xì)胞膜、扼殺細(xì)菌，所W細(xì)菌難W對(duì)其產(chǎn)生抗性。此外，抗菌膚是一 種小分子多膚，是天然存在的一類物質(zhì)，因而不存在殘留的問(wèn)題。因此發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn) 權(quán)的新型抗菌膚產(chǎn)品，替代化學(xué)防腐劑和抗生素，對(duì)于我國(guó)畜牧業(yè)的安全、健康、和諧發(fā)展 具有重要意義。
[0004]防御素是動(dòng)植物體內(nèi)一類富含半脫氨酸的抗菌膚，對(duì)多種微生物均具有較強(qiáng)的防 御能力，是目前頗具吸引力的一類新型候選抗菌藥物。菌絲霉素是丹麥生物技術(shù)公司于 2005年從腐生子囊菌的分泌蛋白中分離出的首例真菌防御素。菌絲霉素的成熟功能片段只 有40個(gè)氨基酸，其分子量約為4. 4KDa，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的殺菌作用，例如肺炎鏈球 菌、脈性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等。此外，菌絲霉素?zé)o細(xì)胞毒性、無(wú)溶血性、腦脊液滲透性 好，且能對(duì)抗肺炎球菌和肺炎鏈球菌，殺滅對(duì)傳統(tǒng)抗生素有抵抗力的一些菌種，不產(chǎn)生耐藥 性，與傳統(tǒng)使用的抗生素之間不存在交叉抗性，因此作為新一代抗生素替代品具有巨大的 發(fā)展?jié)摿Α?br>[0005] 由本公司之前發(fā)明的一種菌絲霉素在釀酒酵母中高效表達(dá)的方法，酵母生長(zhǎng)速率 快，菌絲霉素表達(dá)量高，易于高密度培養(yǎng)，適用于固體或液體發(fā)酵；發(fā)酵過(guò)程中，無(wú)需添加甲 醇誘導(dǎo)，避免了因甲醇?xì)埩魩?lái)的危害；表達(dá)分泌的菌絲霉素易于分離純化，產(chǎn)物純度高。 但是一旦由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，由于培養(yǎng)基中維持質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力 消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，因此外源菌絲霉素基因的表達(dá)量也隨之下降。同時(shí)，相 對(duì)于植物表達(dá)載體而言，酵母的生產(chǎn)成本、技術(shù)要求也更加嚴(yán)格。
[0006] 而青葛（Artemisiacarvi化lia)為一年生草本，具有清熱、涼血、退蒸、解暑、桂 風(fēng)、止癢之效?；ɡ倨诓墒眨钊〉厣喜糠?，切碎，曬干后，可直接用作飼料添加。青葛作為 生產(chǎn)菌絲霉素的植物，還具有粗生易管，生長(zhǎng)期短，投資少，收益快等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用青葛生產(chǎn)菌絲霉素的方法。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0009] 所述用青葛生產(chǎn)菌絲霉素的方法，其特征在于，所述方法包括W下步驟：
[0010] (1)改造載體T202 ;改造后的載體T202序列如SEQIDNO. 1所示；
[0011] (2)構(gòu)建青葛中表達(dá)改造后的菌絲霉素基因的重組質(zhì)粒T202-Plec，重組質(zhì)粒 T202-Plec的序列如沈QIDNO. 2所示；
[0012] (3)用重組質(zhì)粒T202-Plec轉(zhuǎn)化青葛；
[0013] (4)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因青葛植株，獲得生產(chǎn)菌絲霉素的青葛植株。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（1)所述改造載體T202的過(guò)程如下：
[0015] (a)WpCambial300為模板，用如下引物對(duì)TDNA的pRB序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增（產(chǎn)物 長(zhǎng)度為44化P)，pRB序列如SEQIDNO.6所示：
[0016]引物pRB-Fl:5, -GAATTCACTGGGAATTCCCTGGCGTTA-3'(沈QIDNO. 7);EcoRI
[0017] 引物pRB-Rl:5, -GGTACCCAGCCTGTCGGGTACCTTAGGA-3' (沈QIDNO.8);ΚρηΙ
[0018] (b)將PCR擴(kuò)增得到的pRB序列測(cè)序鑒定；將正確的pRB序列連接到pCambial301 上，得到載體PC13001T，載體PC13001T序列如沈QIDNO. 3所示；
[0019] (C)用ΚρηΙ和Smal酶切Actin啟動(dòng)子，同時(shí)用ΚρηΙ和PmacI酶切載體PC13001T， 將酶切的載體PC13001T與酶切的Actin啟動(dòng)子進(jìn)行連接，構(gòu)建成改造后的載體T202。
[0020] 優(yōu)選地，步驟似所述構(gòu)建青葛中表達(dá)改造后的菌絲霉素基因的重組質(zhì)粒 T202-Plec的過(guò)程如下：
[0021] (a)合成改造后的菌絲霉素基因序列，并將其保存于PMD19Simple質(zhì)粒中，改造后 的菌絲霉素基因序列如SEQIDNO. 4所示；
[0022] (b)用如下引物對(duì)保存于PMD19Simple質(zhì)粒中的改造后的菌絲霉素基因進(jìn)行擴(kuò) 增：
[0023]引物PlecF1 :5, -CTGCAGCAAGATGGGTTTTGGTTGT-3'(沈QIDNO. 9);PstI
[0024]引物PlecR1 :5, -TCTAGACTTGTCGTCGTCTTAGTAACAC-3'(沈QIDNO. 10);XbalI [00巧](c)將PCR擴(kuò)增得到的改造后的菌絲霉素基因測(cè)序鑒定；將正確的改造后的菌絲 霉素基因與T-載體連接，得到載體Plec-T，載體Plec-T序列如SEQIDNO. 5所示；
[0026] (d)用PstI、甜aI分別酶切改造后的載體T202和載體Plec-T，將酶切的改造后 的載體T202和酶切的載體Plec-T連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒T202-Plec。
[0027] 下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[002引步驟（1)所述改造載體T202的過(guò)程中，PCR反應(yīng)條件：94°C5min預(yù)變性， 94°C30s-59°C30s-72°C70s，30個(gè)循環(huán)，72°C7min;經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目 的片段，保存于-20°C備用；將得到的pRB片段與T-載體連接，得到pRB-T載體，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌D冊(cè)α菌株，37°C下，用化ndIII和甜alI雙酶切篩選陽(yáng)性菌株，測(cè)序鑒定；將克隆 到的pRB序列連接到pCambial301上，酶切位點(diǎn)為巧coRI-Kpnl，GAATTCGGTACC)，新載 體命名：pC13001T。用化nl和Smal酶切Actin啟動(dòng)子（事先由本課題組成員克隆連接入 pMDlSTVector,并測(cè)序顯不正確），同時(shí)用ΚρηΙ和PmacI酶切pC13001T，與Actin啟動(dòng)子 進(jìn)行連接，構(gòu)建成改造后的載體T202。選擇EcoRI單酶切，應(yīng)出現(xiàn)81化P的條帶。
[002引步驟似中改造克隆菌絲霉素基因的過(guò)程如下：
[0030] 改造菌絲霉素基因的過(guò)程如下：
[0031] (a)利用SeqnConverter軟件分析青葛基因組蛋白編碼序列。
[0032] 從NCBI(ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中篩選蛋白表達(dá)量較高、基因功能 注釋明確的基因，運(yùn)用軟件SeqnConve;rte;r(ht1:p://www.cibj.com/seqnconverter.zip) 分析篩選出的101條完整的蛋白編碼序列，計(jì)算青葛同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymouscodonusage,RSCU):某一密碼子所使用的頻率與其在無(wú)偏性使用時(shí)預(yù)期頻率 之比。如果某一密碼子的同義密碼子相對(duì)使用度（relativesynonymouscodonusage) RSCU= 1，表明該密碼子的使用沒(méi)有偏好性；如果RSCU> 1，表明該密碼子的使用偏愛(ài)性相 對(duì)較高。
[0033] 化）菌絲霉素基因密碼子優(yōu)化
[0034] 在保持菌絲霉素蛋白氨基酸序列不變的前提下，把其中RSCU值小于0. 5的密碼 子替換成青葛偏愛(ài)的密碼子，即在同義密碼子組中RSCU值最大的密碼子；RSCU值在0. 5~ 1. 0之間的密碼子只是部分替換成青葛偏愛(ài)的密碼子；而RSCU值在1W上的密碼子不作改 變。同義密碼子替換過(guò)程中，降低密碼子ACC、AGC、GCC及CCC所占的比例，W減少可能發(fā)生 甲基化的位點(diǎn)。
[0035] (C)化ly(A)加尾識(shí)別位點(diǎn)分析
[0036] 青葛偏愛(ài)密碼子優(yōu)化后的菌絲霉素基因序列可能含有化ly(A)加尾識(shí)別序列。采 用同義密碼子替換法消除化ly(A)加尾識(shí)別序列（AATAAA<SEQIDNO. 17〉，ATTAAA<SEQID NO. 18〉，AACCAA<SEQIDNO. 19〉和AATTAA<SEQIDNO. 20〉），W保證菌絲霉素基因轉(zhuǎn)錄的完 整性。
[0037] (d)內(nèi)含子切割識(shí)別序列分析
[0038] 上述優(yōu)化后的菌絲霉素基因序列可能存在內(nèi)含子剪切信號(hào)序列。用SoftBerry在 線服務(wù)器化ttp:/linuxl.sof憂erry.com/berry.地tml)預(yù)測(cè)出潛在的內(nèi)含子切割識(shí)別序 列，再W同義密碼子替換法消除內(nèi)含子切割識(shí)別序列，W保證菌絲霉素基因轉(zhuǎn)錄的完整性。
[0039] 對(duì)改造后的菌絲霉素基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)條件：94°C5min預(yù)變性， 94°C30s-56°C30s-72°C20s，30個(gè)循環(huán)，72°C7min;經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目 的片段，保存于-20°C備用；將得到的菌絲霉素基因與T-載體連接，得到載體Plec-T，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌D冊(cè)α菌株，37°C下，用PstI和甜alI雙酶切篩選陽(yáng)性菌株，測(cè)序鑒定。
[0040] 步驟似中步驟（d)的具體過(guò)程為：用PstI、甜aI分別酶切改造后的載體T202 和載體Plec-T，產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后，回收菌絲霉素基因片段和載體T202片段； T4連接酶，16°C連接化得到重組質(zhì)粒T202-Plec，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)α菌株；轉(zhuǎn)化后提取質(zhì) 粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。將檢測(cè)正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 步驟（3)是用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法侵染青葛并得到轉(zhuǎn)基因青葛苗；篩選陽(yáng)性植 株，并進(jìn)行PCR鑒定，所述篩選陽(yáng)性菌株的方法是利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)其表達(dá)量。 野生的青葛里面沒(méi)有菌絲霉素，所W只要轉(zhuǎn)基因青葛里面有菌絲霉素，就是陽(yáng)性。PCR鑒定 陽(yáng)性率、RT-PCR