一種用于治療阿爾茲海默癥的多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽，該多肽用于預(yù)防及治療阿爾茲海默癥，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默癥（Alzheimer'sdisease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，作為老 年癡呆最常見(jiàn)的一種形式，它具有不可治愈性、進(jìn)行性以及致命性。其主要的病理學(xué)特 征之一就是由于細(xì)胞外β-淀粉樣肽（amyloid-β，Αβ)積累引起的老年斑（Senile plaque,SP)(MastersCL,SimmsG,WeinmanNA,etal.Amyloidplaquecoreproteinin AlzheimerdiseaseandDownsyndrome[J].ProceedingsoftheNationalAcademyof Sciences, 1985, 82(12) :4245-4249)。淀粉樣沉積假說(shuō)將Aβ視為AD發(fā)病機(jī)理的核心，認(rèn) 為是Αβ錯(cuò)誤折疊和自組裝形成的聚集體導(dǎo)致了AD患者腦組織中的一系列病變，并最終導(dǎo) 致癡呆。因此研究者們一度將Αβ聚集抑制劑作為治療AD的可行方法，并設(shè)計(jì)了小分子、 納米粒子、多肽等不同種類(lèi)的抑制劑。
[0003] 近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，在老年斑周?chē)哪承┙饘匐x子（如Fe2+，Cu2+，Ζη2+等）的 濃度明顯要高過(guò)正常的腦組織（KeppΚΡ·BioinorganicchemistryofAlzheimer's disease[J] ·Chemicalreviews, 2012, 112 (10) : 5193-5239.)，因此金屬離子在阿爾茲 海默癥的病理學(xué)中扮演的角色也得到了廣泛的關(guān)注。金屬離子一方面可以改變?chǔ)ˇ碌?聚集行為，而Αβ的不同聚集形態(tài)產(chǎn)生的毒性作用也不相同，研究者普遍認(rèn)為寡聚體是 其中毒性最強(qiáng)的組分（KayedR,HeadΕ,ThompsonJL,etal.Commonstructureof solubleamyloidoligomersimpliescommonmechanismofpathogenesis[J].Scien ce, 2003, 300 (5618) :486-489.)。另一方面對(duì)于像Cu2+這樣具有一定氧化能力的離子具有 催化產(chǎn)生活性氧組分（Reactiveoxygenspecies，R0S)的能力，也會(huì)導(dǎo)致生理毒性的產(chǎn) 生（EskiciG,AxelsenPH.Copperandoxidativestressinthepathogenesisof Alzheimer'sdisease[J] ·Biochemistry, 2012, 51 (32) : 6289-6311.)。因此，金屬離子螯合 劑也成為一種可能的AD的治療手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：現(xiàn)有報(bào)道的多肽類(lèi)Αβ聚集抑制劑或者自身容易發(fā)生聚集有一定細(xì)胞 毒性，或者只能延緩Αβ的聚集，不能完全抑制其毒性；或者需要很大用量才能起效。因此 我們希望設(shè)計(jì)一種更高效的雙功能的抑制劑。既可以抑制Αβ的聚集，又可以有一定金屬 離子螯合的能力，抑制Cu2+在AD發(fā)生發(fā)展中的不良作用。
[0005] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種可用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽，該多肽的氨基酸序列為：Gly-Gly-H is-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR)，本發(fā)明簡(jiǎn)稱(chēng)該肽為GR。 本發(fā)明中該多肽委托吉爾生化（上海）有限公司合成，純度不低于95%。
[0007] 本發(fā)明所述的用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預(yù)防阿爾茲海默癥 藥物中的應(yīng)用。
[0008] 所述的用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預(yù)防阿爾茲海默癥藥物中 的應(yīng)用，把用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽和藥學(xué)上可接受的載體或促血腦屏障穿越 因子制備成丸劑、膠囊劑、片劑或注射劑制劑。
[0009] 本發(fā)明所述的用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽可以通過(guò)螯合銅離子和抑制 Αβ聚集兩種功能共同作用，抑制銅離子誘導(dǎo)的Αβ聚集，并有效降低Cu-Αβ復(fù)合物的神經(jīng) 細(xì)胞毒性，從而具有預(yù)防和治療阿爾茲海默癥的如景。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GR可以螯合銅離子，其結(jié)合常數(shù)約為 1. 38X107M
[0011] 本發(fā)明通過(guò)硫黃素-T熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GR可以抑制銅離子誘導(dǎo)的Αβ的聚集。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)透射電子顯微鏡證實(shí)了GR可以抑制Cu-Αβ復(fù)合物聚集形成纖維。
[0013] 本發(fā)明用過(guò)ΜΤΤ細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明了GR可以有效降低Cu-Αβ復(fù)合物對(duì)于分化后 的PC-12細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0014] 有益效果：本發(fā)明和已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GR是一種雙功能的Αβ聚集抑制肽，其既可以抑制 Αβ的聚集，又可以螯合銅離子，從而減小Cu-Αβ復(fù)合物的神經(jīng)細(xì)胞毒性。本發(fā)明可能形成 預(yù)防和治療阿爾茲海默癥的藥物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是實(shí)施例1中GR與Cu2+結(jié)合強(qiáng)度測(cè)定的ITC結(jié)果圖。
[0017] 圖2是實(shí)施例1中GR對(duì)于Αβ聚集抑制效果的ThT熒光檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018] 圖3是實(shí)施例1中GR抑制Cu-Aβ復(fù)合物聚集形成纖維的TEM結(jié)果圖
[0019] 圖4是實(shí)施例1中GR對(duì)于Cu-Aβ復(fù)合物神經(jīng)細(xì)胞毒性抑制效果的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0021] 本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類(lèi)似目的的 替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類(lèi)似特征中的一個(gè)例子 而已。
[0022] 實(shí)施例1 :
[0023] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0024] 等溫滴定微量熱（ITC) :ITC用于測(cè)定銅離子和GR的螯合能力，本實(shí)施例中采用的 儀器為MicroCalVP-ITC(GE，USA)。將CuCljPGR溶解于 20mMACES(pH7.4，100mMNaCl) 緩沖液中，分別配制成5mM和2. 5mM溶液。首先，將所用溶液真空脫氣15min。CuCl2溶液 置于上方注射器中，GR溶液置于下方反應(yīng)池內(nèi)。滴定過(guò)程中，溫度為37 °C，注射器旋轉(zhuǎn)速度 為307rmp。第一滴延遲時(shí)間120s，體積為2μL。之后，每滴5μL，平衡時(shí)間為210s，共34 滴。滴定結(jié)束，采用Origin7.0軟件采用單結(jié)合位點(diǎn)模型擬合分析，最終得到結(jié)合常數(shù)，反 應(yīng)熵變和反應(yīng)焓變。
[0025] 硫黃素T(ThT)熒光分析：ThT熒光用于測(cè)定Αβ聚集體重β-sheet結(jié)構(gòu)的含量， 本實(shí)施例中采用F-7000熒光光譜儀（Hitachi，Japan)。1)Αβ樣品的預(yù)處理：取lmg的Αβ 樣品溶于lmLHFIP中，室溫震蕩，待Αβ逐漸溶解后，用氮?dú)獍袶FIP吹干，后用DMS0溶解配 置成lmg/mL的Αβ儲(chǔ)備液于-4°C保存。2)將Αβ儲(chǔ)備液及CuCl2,GR分別用10mMHEPES 緩沖液稀釋至培養(yǎng)所需濃度（Αβ組：Αβ20μΜ，Αβ+Cu組：Αβ20μM+Cu5μΜ，Αβ+Cu+GR 組：Αβ20μM+Cu5μM+GR20μΜ)。37°C，120rmp震蕩孵育。3)測(cè)試：在不同時(shí)間點(diǎn)，取lmL 樣品與10yL的ThT工作液（lmg/mL)共混，混勻后加入石英比色皿中測(cè)定。測(cè)量方法為 440nm激發(fā)，485nm發(fā)射，記錄485nm處的峰值，每組樣品測(cè)三次取平均值。
[0026] 透射電子顯微鏡：取10μL培養(yǎng)3天的ThT樣品溶液滴加至銅網(wǎng)上，靜置60s后 用濾紙從反面吸干，后滴加10%的磷媽酸溶液（pH6.8)對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色，靜置60sec后 再用濾紙從反面吸干，晾干后置于干燥器中待測(cè)。
[0027] 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：本研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均采用高度分化的PC12細(xì)胞，PC12細(xì)胞來(lái)源 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。使用的培養(yǎng)基為90 %的 DMEM液加10%的胎牛血清再加1%的雙抗，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37°C，5%C02)。在細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)中采用MTT的方法來(lái)考察抑制劑GR、Αβ、Αβ-Cu復(fù)合物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
[0028]MTT實(shí)驗(yàn)方法：處于正常狀態(tài)的PC12細(xì)胞種植在96孔板中，每孔8000細(xì)胞，置于 培養(yǎng)箱預(yù)先培養(yǎng)24h后細(xì)胞給藥，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h后加MTT，過(guò)4h后要用酶標(biāo)儀檢測(cè) 細(xì)胞存活率（490nm)。各組樣品濃度為（Αβ組：Αβ20μΜ，Αβ+Cu組：Αβ20μM+Cu5μM， Αβ+Cu+GR組：Αβ20μM+Cu5μM+GR20μΜ)。各組樣品均在搖床中37°C孵育一天后進(jìn)行 細(xì)胞給藥。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽，該多肽的氨基酸序列為：617-617_把8-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR)。2. 權(quán)利要求1所述的用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預(yù)防阿爾茲海默 癥藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預(yù)防阿爾茲 海默癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，把用于治療和預(yù)防阿爾茲海默癥的多肽和藥學(xué)上可接 受的載體或促血腦屏障穿越因子制備成丸劑、膠囊劑、片劑或注射劑制劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽結(jié)構(gòu)以及其抑制阿爾茲海默癥患者β-淀粉樣肽(Aβ)聚集的效果。本發(fā)明提供的多肽的氨基酸序列為：Gly-Gly-His-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR,GR)。本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞毒性等實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)GR可以螯合銅離子并有效抑制β-淀粉樣肽(Aβ)的聚集，明顯減小其由于Aβ聚集引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明提供的多肽有可能用于預(yù)防和治療阿爾茲海默癥，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】A61P25/28, A61K38/10, C07K7/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105237628
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510789970
【發(fā)明人】袁直, 王蔚, 張倩, 劉靜, 胡曉宇
【申請(qǐng)人】南開(kāi)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月17日