在人pi3kca (pik3ca)基因中檢測突變的方法和組合物的制作方法
【專利說明】在人PI3KCA(PIK3CA)基因中檢測突變的方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設及癌癥診斷學和用于癌癥治療的伴隨診斷學。特別地，本發(fā)明設及用于 突變檢測的方法和組合物，其可用于診斷和預后，W及預期癌癥治療的效力。 陽00引發(fā)明背景 憐脂酷肌醇3-激酶（PI3K)是胞內(nèi)脂質(zhì)激酶，其調(diào)節(jié)控制細胞增殖和生存、黏著和運 動性的信號傳遞通路（Vivanco和Sawyers, (2002)巧6如〇邱山。砂ZinosifoiJ-jfi打ase 如曲3"cancer,Pfe1:ureRev.Cancer2:489)。PI3KCA(PIK3CA)是 PI3K基因家族的成員，其編碼激酶PllOa的催化亞基。該基因?qū)α鲂纬删哂歇毺氐南?關(guān)性：在全部測試的PI3K基因中，只有PI3KCA被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中突變。在一個研究 中，在32%的結(jié)腸癌、27%的成膠質(zhì)細胞瘤、25%的胃癌、8%的乳腺癌和4%的肺癌中發(fā)現(xiàn)了 PI3KCA基因中的體細胞突變（Samuels等人（2004)化細/rew/e打〇/邸/紅。口打Si打 (Ae尸/施尚洗/76inA歴ancancers,Science304:554)。隨后的研究報告突變還在子宮 癌（24%)、卵巢癌（10%)和宮頸癌（10%)中（Brana和Sui, (2012)Ciinicai沁化>知/?胎打f ofphosphatidylinositol3~kinaseinhibitorsforcancertreatment,BMCMedicine 2012， 10:161)。
[0003] PI3K通過特異激活Akt蛋白質(zhì)將胞內(nèi)Akt/mTOR通路激活。遺傳方法顯示通 過突變體PI3KCA的該通路的組成性激活（constitutiveactivation)促成了對EGFR革己向治療的抗性（Berns等人（2007) ^ 打ai洗打eficSjOjOroacAiofe打化打es thePI3KpathwayasamajordeterminantoftrastuzumabresistanceinbreastCa打cer,CancerCell12:395)。同時，證明完整的（非突變的）PI3KCA活性可W通過特 異的抑制劑進行抑制，從而克服了通路中去調(diào)節(jié)的（disregulated)上游元件的效果(例 如EGFR)，并且最化已經(jīng)開發(fā)了祀向PI3KCA(PllOa)自身的治療劑廟Weic化ar化等 人（2010)StrategiesforOvercomingInherentandAcquiredResistancetoEGFR InhibitorsbyTargetingDownstreamEffectorsintheRAS/PI3KPathway，Current CancerDrugTargets, 10:824;和Br曰n曰和Sui, (2012)Clinicaldevelopmentof phosphatidylinositol3-kinaseinhibitorsforcancertreatment,BMCMedicine 2012，10:161 中綜述)。
[0004] 總之，運些研究證明了對于檢測PI3KCA基因中體細胞突變W向?qū)で箪胂虬┌Y治 療的患者進行個人化醫(yī)療保健的方法和工具的需求。 陽0化]至今，已鑒定了PI3KCA基因中超過30個體細胞突變(美國專利號8, 026, 053)。大 多數(shù)突變聚集在外顯子9和20中。然而，許多臨床顯著的突變已被報告也在外顯子1、4和 7中。診斷測定應當祀向盡可能多的運些突變。此外，精確的辨別搞特異性)是需要的，因 為測定的結(jié)果將決定患者的癌癥治療過程。
[0006] 發(fā)明概述 本發(fā)明包括用于檢測人PIK3CA基因中每個突變H1047LH1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q54化和Q546K的寡核巧酸，所述寡核 巧酸與W下：SEQIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219中的一個 至少90%相同并且具有其3' -端核巧酸。
[0007] 在另一個實施方案中，本發(fā)明是測定樣品的人PIK3CA基因中一個或多個突變 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K的存在的方法，其包括將樣品與每個突變的一個等位基因特異性核巧酸寡核巧酸 接觸，所述寡核巧酸與選自沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、 219的寡核巧酸具有至少90%同一性并且具有與其相同的3-端核巧酸。在該實施方案的變 化中，寡核巧酸選自沈QIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和 228。
[0008] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于檢測在PIK3CA基因中一個或多個突變 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K突變的一組寡核巧酸，其包含與沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、 185、197、208和219具有至少90%同一性并且具有與其相同的3-端核巧酸的兩個或多個寡 核巧酸的組合。在該實施方案的變化中，寡核巧酸選自SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、 141、166、170、194、199、217和 228。
[0009] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于檢測在PIK3CA基因中一個或多個突變 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K的反應混合物，其包含對每個突變的一個等位基因特異性寡核巧酸，所述寡核巧 酸與選自SEQIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核巧酸具 有至少90%同一性并且具有與其相同的3-端核巧酸。在該實施方案的變化中，反應混合物 包含W下中的一個或多個：SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和 228。
[0010] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是在患者中評估癌癥的方法，其通過使用對每個 突變的一個等位基因特異性寡核巧酸在患者樣品中檢測PIK3CA基因中的一個或多個突變 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K，所述寡核巧酸與選自沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、 208、219的寡核巧酸具有至少90%同一性并且具有與其相同的3-端核巧酸。在該實施方案 的變化中，一個或多個寡核巧酸選自：SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、 199、217 和 228。
[0011] 附圖簡述 O 陽〇1引發(fā)明詳述 定義 為促進該公開的理解，提供了在本文中使用的術(shù)語的如下定義。
[0013] 術(shù)語"X[n]Y"指的是錯義突變，其導致在氨基酸序列內(nèi)的第[n]位上氨基酸X至 氨基酸Y的取代。例如，術(shù)語"H1047R"指的是在第1047位的組氨酸被精氨酸取代的突變。
[0014] 術(shù)語"等位基因特異性引物"或"AS弓I物"指的是雜交至祀序列的多于一種變體， 但是能夠在祀序列的變體之間辨別的引物，因為所述引物只對變體中的一種在合適條件下 通過核酸聚合酶有效地延伸。對祀序列的其它變體，延伸是效率較低的或無效率的。
[0015] 術(shù)語"通用引物"指的是包含等位基因特異性引物的引物對的第二引物。通用引 物不是等位基因特異性的，即，其不在等位基因特異性引物辨別的祀序列的變體之間進行 辨別。
[0016] 關(guān)于癌癥的術(shù)語"評估"指的是推斷癌癥的狀態(tài)或狀況W及確定對診斷程序或治 療的需要，評價治療的潛在效力，監(jiān)控主體的癌癥，或設及癌癥的治療或診斷的任何其它步 驟或方法。
[0017] 術(shù)語"互補的"或"互補性"是根據(jù)有關(guān)Watson-化ick堿基配對原則的多核巧酸 的反向平行鏈使用的。術(shù)語"完全互補的"或"100%互補的"指的是在反向平行鏈之間具有 全部堿基的Watson-化ick配對的互補序列，即，在多核巧酸雙鏈體中的任何兩個堿基之間 沒有錯配。然而，甚至在不存在完全互補性下雙鏈體在反向平行鏈之間形成。