間在比生產(chǎn)相 更高的溫度下解育。例如，細(xì)胞在生長(zhǎng)相期間在約35°c至約38°C之間的第一溫度下培養(yǎng)， 并且在生產(chǎn)相期間在約29°C至約37°C之間，或在約30°C至約36°C之間，或在約30°C至約 34°C之間的第二溫度下培養(yǎng)。此外，在生產(chǎn)相期間可W添加蛋白質(zhì)生產(chǎn)的化學(xué)誘導(dǎo)劑例如 像咖啡因、下酸鹽、W及六亞甲基二乙酷胺（HMBA)。在一個(gè)實(shí)施例中，miRNA或miRNA抑制 劑的活性在生產(chǎn)相期間增加或降低。在一個(gè)實(shí)施例中，在生產(chǎn)相期間誘導(dǎo)了編碼miRNA或 miRNA抑制劑或它們的前體的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施例中，在生產(chǎn)相期間將miRNA 或miRNA載體或寡核巧酸，或抑制劑或它們的前體添加至培養(yǎng)基。
[0081] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（又稱為"宿主細(xì)胞"）可W被基因工程化來(lái)表達(dá)重組多膚例如具 有商業(yè)或科學(xué)利益的多膚。使細(xì)胞系基因工程化通常設(shè)及用重組多核巧酸分子轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化 或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，和/或W其他方式改變（例如，通過(guò)同源重組和基因激活或重組細(xì)胞與非重組 細(xì)胞的融合）W使宿主細(xì)胞表達(dá)所希望的重組多膚。用于使細(xì)胞和/或細(xì)胞系基因工程化 W表達(dá)多膚的方法和載體是已知的。適用于產(chǎn)生重組多膚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括但不 限于：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢畑0)細(xì)胞、小鼠骨髓瘤（NSO)、人胚腎她K293)、幼倉(cāng)鼠腎度HK)細(xì) 胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、人子宮頸癌傳代細(xì)胞、馬下達(dá)比犬腎（MDCK)細(xì)胞、CVl猴腎細(xì)胞、3T3 細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系如NSO和NS1、PC12、WI38細(xì)胞、COS細(xì)胞（包括COS-I和C0S-7)、W 及C127。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)增加的或降低的水平的一個(gè)或多個(gè)miRNA。 在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用如上文更詳細(xì)描述的異源miRNA或抗miRNA抑制劑來(lái)穩(wěn) 定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有降低的 miRNA-let-7a活性。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用抗miRNA-let-7a抑制劑轉(zhuǎn)染。
[0082] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞可W維持在多種細(xì)胞培養(yǎng)基中。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞培養(yǎng)基"指代細(xì)胞例如哺 乳動(dòng)物細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)基的配制在本領(lǐng)域中是熟知的。典型地，細(xì)胞培 養(yǎng)基包括緩沖液、鹽、碳水化合物、氨基酸、維生素W及必要的微量元素。細(xì)胞培養(yǎng)基可W含 有或不含有血清、蛋白腺、和/或蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)基可W補(bǔ)充有另外的組分或濃度增加的 組分，如氨基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、緩沖液、抗生素、脂質(zhì)、微量元素等，運(yùn)取決 于有待培養(yǎng)的細(xì)胞的要求和/或所希望的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。包括無(wú)血清的且限定的培養(yǎng)基的 不同培養(yǎng)基是可商購(gòu)的，并且包括但不限于：最小必需培養(yǎng)基（MEM，西格瑪（Sigma),圣路 易斯（St.Louis),密蘇里州（Mo.)) ;Ham'SFlO培養(yǎng)基（西格瑪）；達(dá)爾伯克氏改良伊格爾 氏培養(yǎng)基值MEM，西格瑪）；最小必需培養(yǎng)基（MEM);伊格爾氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基度ME) ;RPMI-1640 培養(yǎng)基（西格瑪）；HyClone細(xì)胞培養(yǎng)基（HyClone，洛根化ogan)，猶他州扣t址)）；W及化 學(xué)成分確定的（CD)培養(yǎng)基，它們針對(duì)特定細(xì)胞類型進(jìn)行配制，例如CD-OlO培養(yǎng)基（英杰公 司（Invitrogen)，卡爾斯己德（Carlsbad)，加利福尼亞州（Calif.))?？蒞將諸如W上所述 的那些的補(bǔ)充組分或成分添加至可商購(gòu)的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)基可W包括miRNA 或miRNA抑制劑、寡核巧酸或它們的前體，或編碼miRNA或miRNA抑制劑或它們的前體的表 達(dá)載體。
[0083] 由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的重組多膚可W在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，或分泌到可W對(duì)它們 回收和/或收集的培養(yǎng)基中。此外，可W使用已知方法和可從商業(yè)廠家獲得的產(chǎn)品來(lái)從培 養(yǎng)物純化或部分純化重組多膚。純化的多膚之后可W被"配制"，例如緩沖液交換、滅菌、成 批包裝、和/或包裝W供最終用戶使用。
[0084] 細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生特征可W通過(guò)W下內(nèi)容確定：測(cè)量活細(xì)胞密度（VCD)、抗體滴 度、W及生產(chǎn)率，該生產(chǎn)率包括比生產(chǎn)率怕P)、累積生產(chǎn)率W及峰值VCD時(shí)評(píng)價(jià)的最大生產(chǎn) 率。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物包括具有降低的miRNA-let-7a活性的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。在一個(gè)實(shí)施例中，miRNA-let-7a活性被微小RNA抑制劑降低。在一個(gè)實(shí)施例中，微小 RNA抑制劑是miRNA-let-7a的反義寡核巧酸抑制劑。在一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用編 碼miRNA-let-7a的反義抑制劑的可復(fù)制表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì) 胞用miRNA-let-7a的寡核巧酸抑制劑轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施例中，寡核巧酸抑制劑被化學(xué)修飾 例如W改進(jìn)核酸酶抗性，W通過(guò)RISC提高對(duì)miRNA引導(dǎo)的裂解的抗性和/或提高結(jié)合親和 力。在一個(gè)實(shí)施例中，具有降低的miRNA-let-7a的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括miRNA-let-7a基因 敲除。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對(duì)照細(xì) 胞培養(yǎng)物相比較增加至少約25%的生產(chǎn)率。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)率"指代細(xì)胞培養(yǎng) 物在一段限定的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的重組多膚的濃度。生產(chǎn)率可W基于測(cè)量結(jié)果如滴度、活細(xì)胞 密度（VCD)W及活力％來(lái)評(píng)價(jià)。用于測(cè)量滴度、VCDW及活力％的方法是已知的。在一個(gè) 實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物相比較 時(shí)增加至少約 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%W及至多約 100% ;約25%到約100% ;約50%到約75%的比生產(chǎn)率。 W87] 在一個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)率指代比生產(chǎn)率（尹（Yoon)等人，（2006)用于增 強(qiáng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的促紅細(xì)胞生成素體積生產(chǎn)率的兩階段培養(yǎng)策略度iphasic culturestrategyforenhancingvolumetricerythropoietinproductivity ofQiinesehamsterovarycells.)，酶和微生物技術(shù)瓜izymeandMicrobial Technology) 39:362-365 ;鮑曼化aumann)等人，（2008)己斯德畢赤氏酵母的化 氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)提高重組蛋白的比生產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率（Hypoxicfed-batch cultivationofPichiapastorisincreasesspecificandvolumetric productivityofrecombinantproteins.)，生物技術(shù)和生物工程化iotechnology andBioengineering)lOO(l) :177-183;布控辛斯奇化rezinsky)等人，（2003)用于富 集轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的群體^獲得較高比生產(chǎn)率的細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法（Asimplemethodfor enrichingpopulationsoftransfectedCHOcellsforcellsofhigherspecific productivity.)，免疫學(xué)方法雜志（JournalofImmunologicalMe化ods) 277:141-155;福 克斯（Fox)等人，（2003)經(jīng)由溫度變化優(yōu)化通過(guò)中國(guó)倉(cāng)贏卵巢細(xì)胞最大化干擾素-r生產(chǎn)： 實(shí)驗(yàn)和建模（M曰ximizin邑Interferon-yproductionbyChinesehamsterov曰rycells throughtemperatureshiftoptimization:experimentalandmodeling.)，生物技術(shù)和 生物工程85 (2) :177-184 ;武爾姆（Wurm)，（2004)在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白 治療劑（Productionofrecombin曰ntproteintherapeuticsincultiv曰tedmamm曰Ii曰n cells.)，自然生物技術(shù)（化1:ureBiotechnology)22(ll) :1393-1398;布朗尼度rowne) 和艾爾?魯貝阿（A^Rubeai)，（2009)用于高產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的選擇方法（Selection methodsforhi曲-producingmammaliancelllines.)，由艾爾?魯貝阿?M編輯，細(xì)胞 系發(fā)展（CellLineDevelopment),系列：細(xì)胞工程6(Se;ries:Cell!Engineering6)，施 普林格科學(xué)+商業(yè)媒體私人有限公司（SpringerScience+BusinessMediaB.V.)，第127 頁(yè)-第151頁(yè)）。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"比生產(chǎn)率"指代每天培養(yǎng)中每個(gè)活細(xì)胞產(chǎn)生的重組 蛋白，并且可W計(jì)算為產(chǎn)物濃度（滴度）對(duì)累積活細(xì)胞密度的積分的斜率（mg/L/CCD)。在 一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物相 比較時(shí)增加至少約 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%W及至 多約100% ;約25%到約100% ;約50%到約75%的比生產(chǎn)率。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)率指代峰值活細(xì)胞密度（VCD)下確定的"最大生產(chǎn)率"。如 在此所使用，術(shù)語(yǔ)"最大生產(chǎn)率"指代培養(yǎng)處于其最大VCD時(shí)的生產(chǎn)率的水平，并且可W 計(jì)算為與前一時(shí)間點(diǎn)相比較的最大VCD下的滴度的變化除W最大時(shí)間點(diǎn)與先前時(shí)間點(diǎn)之 間的VCD的變化，乘W從第1時(shí)間點(diǎn)到第2時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)天數(shù)，除W最終VCD相對(duì)于最初 VCD的自然對(duì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，與不具有降低的miRNA-let-7a活性的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物 相比較時(shí)，最大生產(chǎn)率增加至少約25%。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低 的miRNA-let-7a活性的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物相比較時(shí)為至少約25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%或 200%或約25%到約200%的最大生產(chǎn)率。
[0089] 在一個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)率指代累積生產(chǎn)率。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"累積生產(chǎn)率" 指代貫穿整個(gè)生長(zhǎng)周期的比生產(chǎn)率，并且可W計(jì)算為產(chǎn)物濃度（滴度）對(duì)累計(jì)活細(xì)胞 密度的積分的斜率（mg/L/CCD)(倫納德巧enard)等人，（1988)單克隆抗體產(chǎn)生動(dòng)力學(xué) 與分批系統(tǒng)中的活細(xì)胞曲線的積分相關(guān)的證據(jù)巧Videncethatmonoclonalantibody productionkineticsisrelatedtotheintegraloftheviablecellscurvein batchsystems.)，生物技術(shù)通訊度iotechnologyLetters) 10(2) :91-96;尹等人，（2006) 用于增強(qiáng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的促紅細(xì)胞生成素體積生產(chǎn)率的兩階段培養(yǎng)策略，酶和微生 物技術(shù)39:362-365;李化i)等人，（2010)用于單克隆抗體生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法（Cell cultureprocessesformonoclonalantibodyproduction.)，單克隆抗體雜志通訊 (mAbs)，2巧)466-477;布拉辛斯奇等人，（2003)用于富集轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的群體W獲得較高 比生產(chǎn)率的細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法，免疫學(xué)方法雜志277:141-155 ;?？怂沟热?，（2003)經(jīng)由溫度 變化優(yōu)化通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞最大化干擾素-丫生產(chǎn)：實(shí)驗(yàn)和建模，生物技術(shù)和生物工 程85 (2) : 177-184)。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物具有與不具有降低的miRNA-let-7a活 性的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物相比較時(shí)增加至少約25%、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、 65%、70%、75%W及至多約100% ;約25%到約100% ;約50%到約75%的累積生產(chǎn)率。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施例中，生產(chǎn)率指代培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率，即，總培養(yǎng)物中的重組多膚細(xì)胞 的滴度對(duì)比對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物中的重組多膚的滴度。
[0091] G.電紀(jì)多化
[0092] 如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"重組多膚"指代由培養(yǎng)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的基因工程化的多 膚或蛋白質(zhì)。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"異源的"指代由宿主細(xì)胞產(chǎn)生但不正常表達(dá)該多膚的重 組多膚。然而，異源多膚可W包括生物天然具有的但已故意W某一方式改變的多膚。例如， 異源多膚可W包括由宿主細(xì)胞表達(dá)的已用表達(dá)多核巧酸的載體轉(zhuǎn)染的多膚。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施例中，多膚是抗體或它的結(jié)合片段?？贵w可W是寡克隆抗體、多克隆抗 體、單克隆抗體、嵌合抗體、駱駝化抗體、CDR移植抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、催化 性抗體、人源化抗體、完全的人抗體、抗獨(dú)特型抗體和能夠W可溶或結(jié)合形式標(biāo)記的抗體， W及它們的包括表位結(jié)合片段的片段、變體或衍生物，它們單獨(dú)存在或與其他氨基酸序列 組合。抗體可W來(lái)自任何物種。術(shù)語(yǔ)抗體還包括結(jié)合片段，包括但不限于：Fv、F油、F油'、 尸(曰6'）2、單鏈抗體（3乂。〇、二聚可變區(qū)（二聚抗體）^及二硫鍵連接的可變區(qū)（(13。乂）。免 疫球蛋白分子可W是任何類型（例如IgGJ姐、IgMJ曲、IgA、W及I巧)、類別（例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAUW及IgA2)或子類。
[0094] 在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多膚是非抗體蛋白。非抗體蛋白的實(shí)例包括但不限于：融 合蛋白、受體、細(xì)胞表面蛋白的配體、分泌的蛋白、W及酶。 陽(yáng)0巧]比試劑念
[0096]任何miRNA或抗miRNA寡核巧酸或表達(dá)載體W及另外的組分如緩沖液、細(xì)胞和培 養(yǎng)基可W封裝在試劑盒形式中。典型地，試劑盒還含有材料如用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的說(shuō) 明書(shū)、封裝材料、W及容器。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括編碼如上文更詳細(xì)描述的miRNA 基因產(chǎn)物或miRNA抑制劑的至少一個(gè)表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)載體可W用于體外 轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，或用于瞬時(shí)地或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括 至少兩個(gè)表達(dá)載體，其中一個(gè)編碼miRNA基因產(chǎn)物或miRNA抑制劑，并且另一個(gè)編碼可選擇 標(biāo)記、報(bào)告子基因或重組多膚。 陽(yáng)〇巧]I.通過(guò)引用的結(jié)合
[0098] 在此引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)、論文、教科書(shū)等W及其中引用的 參考文獻(xiàn)（如同它們還未曾引用過(guò)的程度）通過(guò)引用W其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。
[0099] J.等效物 陽(yáng)100] 前述書(shū)面說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為足W使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明。前述描述和實(shí) 例詳述了本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施例，并且描述了諸位發(fā)明人所期望的最佳模式。然而，將 了解到，無(wú)論前述內(nèi)容W文本形式表現(xiàn)的如何詳細(xì)，本發(fā)明仍可WW多種方式實(shí)踐，并且應(yīng) 根據(jù)隨附權(quán)利要求書(shū)和它的任何等效物來(lái)解釋本發(fā)明。
[0101] 6.操作連例
[0102] 為了研究改變的微小RNA表達(dá)提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)率的能力，兩個(gè)抗體產(chǎn)生 Cffi)細(xì)胞系用慢病毒載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述慢病毒載體基于設(shè)及重組多膚生產(chǎn)如細(xì)胞增殖、 應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡W及mRNA翻譯的路徑中微小RNA的潛在設(shè)及來(lái)編碼9個(gè)不同的微小 RNA或反義微小RNA抑制劑（表1)。
[0…引 A.材料與方法 W 04] 細(xì)胸培養(yǎng)巧轉(zhuǎn)導(dǎo) 陽(yáng)1化]表達(dá)不同單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞（懸浮細(xì)胞系）在補(bǔ)充有50uM k甲硫氨酸亞諷胺（MSX;西格瑪奧德里奇（SigmaAl化ich)，圣路易斯，密蘇里州）和0. 5X GS補(bǔ)充劑（SAFC生物科學(xué)，雷內(nèi)克薩化enexa)，堪薩斯州化巧）的CDC冊(cè)培養(yǎng)基（生命技 術(shù)化ifeTechnologies),卡爾斯己德，加利福尼亞州）中生長(zhǎng)。將搖瓶培養(yǎng)物維持在120 1?^、37°(：、6%0)2^及80%濕度。在2-20的版)1下，用過(guò)表達(dá)11111?-10曰、11111?-21的慢病毒 載體或載體對(duì)照（開(kāi)放生物系統(tǒng)公司的penBiosystems),亨茨維爾化untsville)，