一種用于檢測醋酸格拉替雷樣本的uplc方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測醋酸格拉替雷樣本的超高效液相色譜色譜扣Itra PerformanceLiquidC虹omatography，IPLC)方法及與其配套使用的內標膚組。
【背景技術】
[0002] 自身免疫類疾?。╝utoimmunediseases)是指，生物機體的免疫系統(tǒng)將一些機體 本身的組織當作"外來物"進行攻擊的現象。通常送種疾病可W通過阻礙生物機體T細胞和 B細胞對機體自身組織的反應，得到緩解。送些早期的免疫反應是通過抗原結合到MHC分子 上促進的，并通過T細胞表達出來。自身免疫類疾病就是機體本身的組織和蛋白質被當作 "自抗原"，被機體免疫系統(tǒng)攻擊。例如；多發(fā)性硬化癥，就是免疫系統(tǒng)對隔離和保護神經的 髓銷進行攻擊而導致的疾病，送種疾病發(fā)展到失去髓銷，就會帶來神經元和運動神經功能 喪失；其他例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、自免疫性溶血性貧血等，也屬于此類疾病。
[0003] 很多藥物開發(fā)出來用于治療自身免疫類疾病，包括多發(fā)性硬化癥。醋酸格拉替 雷（又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸通過聚合產生的不同分子量聚 合物的混合物。它的四種氨基酸摩爾比大約是0.392~0.462:0. 129~0. 153:0. 300~ 0. 374:0. 086~0. 100(Ala;Glu;Lys;Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大約5000~ 9000道爾頓。
[0004] 為了能夠確保得到的共聚物-1具有藥效，就必須準確的知道多氨基酸混合物在 合成過程中的平均分子量分布和變化，例如用Superose。色譜柱進行分析確定分子量，但 是，由于對于不確定含量及分子量的聚合物混合物而言，由于沒有標準對照物，因此，進行 分子量檢測時，多使用內標法進行評價，此時，質量合乎標準的內標物質對于檢測結果的準 確性至關重要。
[0005] 對于共聚物-1的內標物，上世紀末，US6514938記載了使用合成的多膚作為內標 物調整色譜柱的校正系數，能夠較為準確測量共聚物-1平均分子量。但是，隨著分離技術 的不斷發(fā)展，尤其是如高分辨的UPLC色譜OJltraPerformanceLiquidQiromatogra地y, 超高效液相色譜）技術的不斷成熟，該方法專屬性不強的缺點就被暴露出來，在如UPLC的 相對嚴格的條件下，需要對該方法進行修正，從而更準確的檢測目標聚合物的分子量及分 子量分布，W便為相關的藥物質量控制提供更為準確的參考。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供一組與目標化合物（共聚物-1)結構相似的內標膚作為共聚物-1分 子量測定用內標W及與其配套使用的UPLC檢測及分離參數，使用該內標能夠在高分辨的 UPLC分離技術時，更準確的測定目標聚合物的分子量及分子量分布。為相關研究提供更為 真實的數據支持。
[0007] 本發(fā)明首先涉及一種用來檢測共聚物-1的UPLC方法，該方法使用BEH125SEC色 譜柱與邸肥OOSEC兩根色譜柱任意串聯(lián)的UPLC系統(tǒng)，柱參數為1. 7um，4. 6X150mm;使用抑 值3. 0-5.O(優(yōu)選為3. 5)、濃度0. 1-0. 5mol/l(優(yōu)選為0. 25)的甲酸倭或己酸倭作為緩沖 液；將所述緩沖液與己臘按照緩沖液；己臘=1:9配制流動相；所述流動相通過過濾法除菌 除雜。
[000引本發(fā)明所述的UPLC方法中，繪制內標膚校準曲線和檢測目標共聚物-1時的方法 參數還包括，本發(fā)明所述的串聯(lián)色譜柱系統(tǒng)的進樣和檢測樣本時，柱溫控制在30-6(TC，優(yōu) 選為5(TC;根據所述的串聯(lián)系統(tǒng)，制備標準曲線時內標膚組的進樣量為1-20U1，樣品濃度 0.Ol~0.Img/ml，優(yōu)選為0. 05mg/ml;根據所述的串聯(lián)系統(tǒng)，檢測目標共聚物-1時，樣品的 濃度為 0. 1-lOmg/ml,優(yōu)選為 4mg/ml。
[0009] 本發(fā)明所述的UPLC方法中，所使用的內標膚組合共包含7條內標膚，所述的內標 膚序列見表1
[0010] 表1.內標膚組合的序列結構及分子量

【附圖說明】
[001引圖1、本發(fā)明所述的內標膚組不同條件下的色譜圖：圖la.使用本發(fā)明所述UPLC方法配合內標膚組進行UPLC色譜校正時的色譜圖；圖化.使用普通HPLC方法混合進樣標 定本發(fā)明所述的內標膚組時的HPLC圖譜；圖Ic.使用普通HPLC方法分別進樣標定本發(fā)明 所述的內標膚組時的HPLC擬合圖譜。
[001引圖2、本發(fā)明所述的內標膚組的校正曲線：圖2a.使用本發(fā)明所述UPLC方法配合 內標膚組進行UPLC色譜校正時的校正曲線；圖2b.使用普通HPLC方法和本發(fā)明所述的內 標膚組校正時的校正曲線。
[0014] 圖3、聚合物-1的典型UPLC色譜圖：圖3a.使用本發(fā)明所述UPLC方法獲得的典 型共聚物-I的色譜圖；圖3b.使用普通HPLC方法獲得典型共聚物-I的色譜圖。
[0015] 圖4、4a、4b、4c本發(fā)明所述的內標膚組的UPLC分離圖譜
【具體實施方式】
[0016] 實施例1.內標膚組的合成及性質
[0017] 分子量從5400-17000道爾頓的走條內標膚由本公司自行合成。送些內標膚編號 為TV-##，其中##為氨基酸殘基數目（例如；TV-35就是含有35個氨基酸殘基的膚鏈）。氨 基酸的組成與共聚物-1的特征值相符（表2)。
[0018] 表2.內標膚組的各內標膚氨基酸組成
[0021] 實施例2.W本發(fā)明UPLC-SEC超高壓液相色譜方法，使用內標膚組校正色譜柱并 測量共聚物-1的分子量及分子量分布
[0022] 用WatersAC卵口YUPLCB邸 125SEC色譜柱與WatersAC卵口YUPLC邸肥00沈C 兩根色譜柱進行串聯(lián)（注；兩根色譜柱均為1.7um，4.6X150mm)，W〇.25mol/1的甲酸倭 (用甲酸調抑3. 5)與己臘按9 ;1的比例混合，過0. 2um濾膜后作為流動相，檢測波長為 275皿，流速為0. 2ml/min，柱溫；5(TC。對送走個內標膚的進行校正，內標組的每一個內標 膚的進樣濃度為0. 〇5mg/ml，進樣10U1，走個樣本一起進樣，獲得的UPLC分離圖譜見圖la， 可見，采用該方法，能夠很好的將內標膚進行分離。同時，送組內標膚與共聚物-1的保留時 間與其對應分子量的對數呈一定的相關性，對送走個內標膚的進行校正，其公式為；IogMw =A+BXRT，校正曲線采用的數據如下表3,由此得出的校正曲線見圖2曰，對共聚物-1的典 型樣本進行檢測，色變圖見圖3曰。
[0023]表3.使用本發(fā)明所述UPLC方法配合內標膚組繪制校正曲線時采用的數據
[00巧]隨后，W同樣的UPLC參數，對不同