14化-15與C-30化-11與C-9 ; H-Ila與C-8W及&-19與C-9的相關(guān)性驗證了 30, 9-運個官能團的連接關(guān)系。綜合氨譜、 碳譜、HMBC譜和NOESY譜，W及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所 示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖2)。
[002引實施例2 :化合物（I)藥理作用試驗
[0027] 一、材料和儀器
[0028]HepG2人肝癌細胞株購自中科院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。L02正常人肝細 胞株由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所饋贈。化合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%。 RPMI-1640培養(yǎng)基、膜酶購自Gibco公司。標準小牛血清購自Biowest公司。3-(4,5-二甲 基嚷挫-2)-2,5-二苯基四氮挫漠鹽曲1'1')、二甲基亞諷〇^50)、臺吩藍燈巧口曰址山6)、二氯 巧光素雙醋酸鹽值CFH-DA)均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。其他常用試劑均為分 析純。
[0029] 微量天平（瑞±梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通臺式離屯、機（上海 安亭科學(xué)儀器廠）。數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療機械廠，皿.W21.600巧。二氧 化碳細胞培養(yǎng)箱（美國化rmaScientific公司）。高速冷凍離屯、機（美國Thermo公司， IECMICROMAXRF)。超微量紫外分光光度計（美國IliermoHsher公司，NanoDrop-1000 )。 紫外成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司，F(xiàn)R-200A)。酶聯(lián)免疫檢測儀，巧光分光光度計 化itachiF2500)。
[0030] 二、試驗方法 [00引]1、細胞培養(yǎng)
[0032] 將細胞常規(guī)接種于含10% (體積分數(shù)）小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于 37°C、5%C〇2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033] 2、化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液的配置
[0034] 將45. 44mg化合物（I)溶于10血二甲基亞諷（DMSO)制得儲備液并分別稀釋2 倍、4倍，分別得到2mmol/l、4mmol/L及8mmol/L的化合物（I)應(yīng)用液。進行細胞干預(yù)前， 將50yL應(yīng)用液與4950yL常規(guī)培養(yǎng)液（含10 %體積分數(shù)的小牛血清）充分混合，得到化 合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液（2〇ymol/l、40ymol/l、8〇ymol/L)。
[003引 3、MTT法檢測細胞存活率
[0036] 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200yL巧XIO3細胞）。培養(yǎng)1化待 細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200yL不同濃度的化合物（I)培養(yǎng)液值MSO溶解化合物(I)后W1%體積分數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)液混合，使化合物（I)終濃度為20ymol/l、40ymol/ L80ymol/L)，每組6個平行孔。同時設(shè)6個溶劑值MS0)對照孔。培養(yǎng)2地、4她、72h，每 24小時更換化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液。干預(yù)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，向各孔加入20yLMlT溶 液，37°C解育4h后吸去各孔上清液，加入150yLDMSO,置搖床上低速震蕩lOmin，待結(jié)晶充 分溶解后，WDMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度，計算細胞存活率 (survivalrate，SR)。SR=實驗組A49。/ 對照組AasqX100%
[0037] 4、臺吩藍染色測定存活細胞數(shù)
[003引將相同數(shù)量（2X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后，棄 去培養(yǎng)液，用PBS洗細胞兩遍后，加入5mL的化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液（20ymol/l、40iimol/ L80iimol/L)。每組S瓶細胞，同時設(shè)立S瓶溶劑值MS0)對照。培養(yǎng)4化后，用0. 25%膜 酶消化細胞，收集細胞懸液，臺吩藍染色測定細胞數(shù)。
[0039] 5、DCFH-DA法測定細胞內(nèi)ROS活性
[0040] 將相同數(shù)量（2X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后， 吸去原培養(yǎng)液，加入5mL化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4化后，棄去培養(yǎng)液，膜酶消 化細胞，收集細胞懸液于1. 5血EP管中，150化pm離屯、5min，棄上清，向沉淀中加入1血 DCFH-DA，吹打混勻，37°C解育30min，加入PBS終止反應(yīng)，離屯、收集沉淀并溶解于1血PBS， 吹打成均勻細胞懸液，用Hitachi-F2500焚光分光光度計測定巧光值。激發(fā)波長488nm，發(fā) 射波長525nm。
[0041] S、結(jié)果及結(jié)論
[004引 1、細胞生長存活率
[0043] 胎pG2細胞經(jīng)化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)2地、4她、7化后，低、中、高劑量組的細胞存活 率均顯著低于溶劑對照組（P<〇. 05)，且細胞存活率下降的程度與化合物（I)干預(yù)濃度之 間存在一定劑量效應(yīng)趨勢（表1，平<0. 05VS對照組；bp<〇. 05VS低劑量組；平<0. 05VS中劑量 組）。在同一化合物（I)干預(yù)濃度下，細胞存活率隨著干預(yù)時間的增加而呈現(xiàn)下降的趨 勢。而同等條件下，L02人正常肝細胞經(jīng)化合物（I)干預(yù)后，細胞存活率無顯著變化（表 2)。臺吩藍染色細胞計數(shù)結(jié)果與MTT-致（圖3,平<0. 05VS對照組；bp<〇. 05VS低劑量組； 平<0. 05VS中劑量組）。
[0044] 2、細胞內(nèi)ROS活性
[0045] 胎pG2人肝癌細胞經(jīng)不同濃度化合物（I)干預(yù)后，與對照組相比，細胞內(nèi)ROS水 平顯著下降（P<〇. 05)。結(jié)果見表3 (平<0. 05VS對照組；bp<〇. 05VS低劑量組）。
[0046] 結(jié)論，采用不同濃度的化合物（I)對人肝癌細胞化pG2進行干預(yù)處理，經(jīng)MT比 色及臺吩藍染色細胞計數(shù)表明，化合物（I)能夠有效抑制化pG2細胞的生長增殖，干預(yù)組 細胞的存活率較對照組顯著降低，且降低程度與化合物（I)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨 勢，同時在同一化合物（I)濃度下，細胞存活率隨著干預(yù)時間的增加而呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨 勢。與此同時，相同劑量的化合物（I)干預(yù)對L02正常肝細胞并不產(chǎn)生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)對胎pG2細胞生長存活率的影響（X+S，n= 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)對L02細胞生長存活率的影響（x±s，n=6)
[0052] 表3化合物（I)對胎pG2細胞ROS水平的影響（X+S，n= 6)
[0053]
[0054] 實施例3
[0055] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[005引 實施例4
[0057] 口服液制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0058] 實施例5
[0059] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0060] 實施例6
[0061] 注射液的制備：按實施例I方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[00的]實施例7
[0063] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0064] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：（a)將 燈臺樹的干燥葉粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用 75%乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步 驟（b)中75%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30 :1、10:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一步分 離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟 (d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等 度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：步驟（a)中，用80%乙 醇熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于：該藥物組合物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的 化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的三萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類化合物，可以從燈臺樹的干燥葉中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，干預(yù)組細胞的存活率較對照組顯著降低，且降低程度與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨勢。化合物(Ⅰ)在治療肝癌方面具有潛在的應(yīng)用價值，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61P1/16, C07J71/00, A61K31/585
【公開號】CN105218617
【申請?zhí)枴緾N201510640790
【發(fā)明人】宋曉梅
【申請人】宋曉梅
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月30日