0064]用堿液消化RNA-DNA中的RNA鏈：即向上述反應(yīng)體系中直接加入下列試劑：1 y 1化OH (IOM)、2 y 1邸TA (0. 5M)、177 y 1 d地2〇,形成200 y 1體系。在Iliermomixer恒溫混勻 儀中65°C，800巧m振蕩反應(yīng)15分鐘后，直接加入60 Tris-HCUlM, pH 7.0)混勻后，進(jìn) 行酪氯仿抽提和乙醇沉淀，將沉淀溶解于10y1d地2〇中。 W65] 實(shí)施例3
[0066]dsN6接頭與第一鏈cDNA連接
[0067] 將沉淀得到的單鏈CDNA于65°C加熱5分鐘，并立即置于冰上。將5'接頭dsN6置 于37°C加熱5分鐘后，立即置于冰上。在PCR管中配成如下反應(yīng)體系：
[0068]
[0069]在PCR儀上設(shè)置16 °C連接過(guò)夜。 陽(yáng)070] 其中，dsN6接頭的序列如下：
[0071]dsN6-top:
[0072] 5' -ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3,；
[0073]dsN6-bot:
[0074] 5' -AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGT-3'。 陽(yáng)0巧]實(shí)施例4
[0076]第二鏈CDNA合成 陽(yáng)077] 在過(guò)夜連接反應(yīng)體系中直接進(jìn)行第二鏈cDNA合成，在PCR管中配成如下反應(yīng)體 系：
[0078]
陽(yáng)0巧]在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序如下：
[0080] 65 °C Smin
[0081] 68°C 30min
[0082] 72°CIOmin。 W83] 將上述產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳，并進(jìn)行瓊脂糖膠純化回收，即用QIAquickGel ExtractionKit(QIAGEN，德國(guó)）說(shuō)明書中的方法，割膠回收300-1000bp片段。
[0084] 實(shí)施例5
[00財(cái)測(cè)序引物的引入
[0086] 利用PCR的方法，通過(guò)之前引入雙鏈CDNA中的測(cè)序引物的部分，將其余的測(cè)序引 物部分也引入雙鏈CDNA中，并擴(kuò)增雙鏈CDNA。在PCR管中配成如下反應(yīng)體系：
[0087]
陽(yáng)0蝴 PCR設(shè)定程序如下：
[0089] 98°C 30S 98c'C 15 S --1 69〇C 15S* X5個(gè)早巧壞 ITC 30S」
[0090] 98〇C 15 S、 66〇C!5s^ X]5 個(gè)祝壞 72〇C 30 s一 72°CIOmin 4°C 維持
[0091] 其中，引物陽(yáng)2_AFN2_shod序列為：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTC CCTACA-3' ；
[0092]引物Nan〇-N9-P7-PCR序列為：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAG TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAGCA-3';
[0093]引物陽(yáng)2_A_shod序列為：5' -AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'；
[0094]引物陽(yáng)2_B_shod序列為：5 ' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3 '。
[0095] 至此，可W獲得加入了測(cè)序引物的序列文庫(kù)，可W用于生物學(xué)分析。比如，通過(guò)高 通量測(cè)序的方法，研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA。
[0096] W上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng) 造性勞動(dòng)就可W根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可W得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，提供了一種反轉(zhuǎn)錄隨 機(jī)引物，包括形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列以及隨機(jī)堿基序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列包括 用于識(shí)別RNA鏈信息的條碼堿基序列和與測(cè)序引物部分相同的堿基序列。2. 如權(quán)利要求1所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，所 述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物中條碼堿基至少為7個(gè)。3. 如權(quán)利要求1所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，所 述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物的序列為： 5' -GTGCTCTTCCGATCTAGAGCANNNNNNNNN-3'，第 15-21 位為條碼堿基序列。4. 如權(quán)利要求1所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，還 提供了一種雙鏈接頭，所述雙鏈接頭的一條鏈包括與測(cè)序引物堿基序列中的一部分相同的 堿基序列，并且，相對(duì)于配對(duì)的另一條鏈，在3'端還具有突出的隨機(jī)堿基序列。5. 如權(quán)利要求4所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，所 述雙鏈接頭兩條鏈的序列分別為： 5'-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3' ；5'-AGATCGGAAGAGCG TCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGT-3? 〇6. 如權(quán)利要求5所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，所 述雙鏈接頭中與測(cè)序引物堿基序列中的一部分相同的堿基序列可以增加或減少。7. 基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，包括以下步驟： 1) 通過(guò)RNA免疫沉淀將獲得與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄合成第一鏈cDNA ; 2) 通過(guò)鏈置換方法引入已知序列，隨后引入測(cè)序引物； 其中，所述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物包括形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列以及隨機(jī)堿基序列，形成發(fā) 卡結(jié)構(gòu)的堿基序列包括用于識(shí)別RNA鏈信息的條碼堿基序列和與測(cè)序引物部分相同的堿 基序列。8. 如權(quán)利要求7所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中，在 所述步驟1)之后，利用酶消化過(guò)量的所述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物，并堿解與所述第一鏈cDNA雜合 的RNA ;再利用雙鏈接頭與所述第一鏈cDNA退火雜交，引入已知序列，隨后引入測(cè)序引物， 其中，所述雙鏈接頭的一條鏈包括與測(cè)序引物堿基序列中的一部分相同的堿基序列，并且， 相對(duì)于配對(duì)的另一條鏈，在3'端還具有突出的隨機(jī)堿基序列。9. 如權(quán)利要求8所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法， 其中，所述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物的序列為： 5' -GTGCTCTTCCGATCTAGAGCANNNNNNNNN-3' ； 其中，所述雙鏈接頭兩條鏈的序列分別為： 5'-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3' ；5'-AGATCGGAAGAGCG TCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGT-3? 〇10. 如權(quán)利要求8所述的基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，其中， 通過(guò)兩對(duì)引物 PE2_AFN2_short 和 Nan〇-N9-P7-PCR 以及 PE2_A_short 和 PE2_B_short，在引 入雙鏈接頭后的產(chǎn)物上，通過(guò)PCR引入測(cè)序引物的剩余部分，其中， 引物PE2_AFN2_short序列為： 5' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACA-3' ； 引物Nan〇-N9-P7-PCR序列為： 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAG CA-3' ； 引物PE2_A_short序列為： 5' -AATGATACGGCGACCACCGAGA-3' ； 引物PE2_B_short序列為： 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3、
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于高通量測(cè)序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的方法，提供了一種反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物，包括形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列以及隨機(jī)堿基序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列包括用于識(shí)別RNA鏈信息的條碼堿基序列和與測(cè)序引物部分相同的堿基序列。還提供了一種雙鏈接頭，所述雙鏈接頭的一條鏈包括與測(cè)序引物堿基序列中的一部分相同的堿基序列，并且，相對(duì)于配對(duì)的另一條鏈，在3’端還具有突出的隨機(jī)堿基序列。該方法主要包括以下步驟：將獲得的與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA利用反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；酶消化過(guò)量反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物并堿解RNA；雙鏈接頭與所述第一鏈cDNA退火雜交，引入已知序列，隨后引入測(cè)序引物，最終形成雙端測(cè)序文庫(kù)用于測(cè)序。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105154567
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510672118
【發(fā)明人】趙小東, 邵志峰, 康亞妮, 戚穎
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日