基于高通量測序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的rna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及設(shè)及一種基于高通量測序的全基因組范圍內(nèi)研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的 RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在全基因組范圍內(nèi)研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的高通量測序方法目前只有一種， 即RIP-seq(RNAimmunoprecipitationSequencing,RNA免疫沉淀測序）（ZhaoJ,Ohsumi TK,KungJT,etal.Genome-wideidentificationofpolycomb-associatedRNAsby RIP-seq.MolCell. 2010, 40:939-953)。運種方法主要通過RNA免疫沉淀，獲得與目標(biāo)蛋白 結(jié)合的RNA，將獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，然后可W應(yīng)用于PCR擴(kuò)增、文庫構(gòu) 建、RACE及其他的分子生物學(xué)實驗。
[0003] RIP-seq中的文庫構(gòu)建，可W識別鏈特異性、可W適用于少量RNA高通量測序文庫 的構(gòu)建，從而在全基因組范圍內(nèi)研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA。
[0004] 上述現(xiàn)有的RIP-seq(ZhaoJ,OhsumiTK,KungJT,etal.Genome-wide identificationofpolycomb-associatedRNAsbyRIP-seq.Mol Cell. 2010, 40:939-953)的過程如下：首先，通過常規(guī)方法進(jìn)行RNA免疫沉淀。主要步驟 為：分離細(xì)胞核，制備細(xì)胞核溶解產(chǎn)物，用面ase進(jìn)行處理，并與結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體進(jìn)行 解育，用proteinA瓊脂糖珠子對RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行免疫沉淀。其次，進(jìn)行RNA的抽 提，一般使用Trizol法抽提RNA。第S，進(jìn)行第一鏈CDNA的合成，其實驗原理圖如圖1所 示，利用某些反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，會自動在新合成的第一鏈CDNA末端添加幾個 核巧酸，通常是脫氧胞喀晚（dC)，而鏈置換引物在3'端含有脫氧鳥嚷嶺（dG)，可W與富含 dC尾的第一鏈CDNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄酶可W轉(zhuǎn)換模板繼續(xù)合成至鏈置換引物結(jié)束。運樣合成的 第一鏈CDNA的兩端都具有已知序列。第四，Illumina測序引物的引入，W上述兩端都具有 已知序列的第一鏈CDNA為模板，合成第二鏈，然后在DNA鏈一端加上Illumina測序引物， 從而形成適用于測序的文庫。
[0005] 但是，利用現(xiàn)有的RIP-seq方法，檢測到的RNA分子是有偏好性的。有數(shù)據(jù)表明， 利用上述RIP-seq方法構(gòu)建的文庫，對5'端是G的RNA更容易檢測到，因為對于5'端是 G的RNA，在第一鏈CDNA合成時，其模版置換效率明顯高（GuptaRA,Sh址N，WangKC，et al.Longnon-codingRNAHOTAIRreprogramschromatinstatetopromotecancer metastasis.化1:腳6. 2010, 464:1071-1076.)。所W，該方法對RNA的檢測有偏好性。而且， 該方法是單端測序的方式，只在DNA鏈的一端引入了測序引物，不適用于雙端測序。
[0006] 此外，現(xiàn)有技術(shù)的RNA測序方法中（如圖2所示），RNA反轉(zhuǎn)錄后和CDNA鏈形成雙 鏈，然后直接加接頭（P5和P7)，測序時為雙端測序，因此，測序時不知道測的是CDNA鏈還是 原來RNA鏈，所W不能判斷RNA鏈信息。而通過上述RIP-seq方法，通過鏈置換方法，利用 加入的鏈置換引物中GGG來判斷RNA鏈的信息，測到GGG序列是來自RNA鏈的，而測到CCC 序列就是來自CDNA鏈。但是，如上所述，由于該方法對RNA的檢測有偏好性，5'端是G的 RNA更容易檢測到，運也就使該方法在判斷RNA鏈信息方面存在不穩(wěn)定性。
[0007] 另外，在RNA測序方法中，在雙鏈DNA兩端加上Illumina的P5和P7測序接頭的 過程中，由于在加入P5和P7測序引物后需要純化，在PCR之后還需要純化，運兩步純化步 驟就導(dǎo)致了樣品的損失。
[000引因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠避免檢測RNA的偏好性、提高判斷RNA鏈信息準(zhǔn)確性并減少樣品損失的RIP-seq方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠避免檢 測RNA的偏好性、提高判斷RNA鏈信息準(zhǔn)確性并減少樣品損失的RIP-seq方法。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于高通量測序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的 RNA的方法，其中，提供了一種反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物，包括形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列W及隨機(jī)堿 基序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列包括用于識別RNA鏈信息的條碼堿基序列和與測序引物 部分相同的堿基序列。條碼堿基序列用于判斷RNA鏈信息，并減少偏好性。條碼堿基序列 的設(shè)計原則是不與要進(jìn)行測序的生物體的基因組上的任意一段序列重疊。由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)不 會與RNA退火，因此可W進(jìn)一步降低可能產(chǎn)生的偏好性。
[0011] 進(jìn)一步地，上述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物中條碼堿基至少為7個。
[0012] 進(jìn)一步地，上述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物的序列為：
[0013] 5' -GTGCTCTTCCGATCTAGAGCANNNNNNNNN-3'，其中第 15-21 位為條碼堿基序列。
[0014] 可選地，上述反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物中與測序引物部分相同的堿基序列可W加長或縮短 1至2個堿基。隨機(jī)堿基的數(shù)量也可變，可W是6-15個，優(yōu)選為9個。
[0015] 進(jìn)一步地，本方法還提供了一種雙鏈接頭，該雙鏈接頭的一條鏈包括與測序引物 堿基序列中的一部分相同的堿基序列，并且，相對于配對的另一條鏈，在3'端還具有突出的 隨機(jī)堿基序列。該雙鏈接頭的3'端突出的隨機(jī)堿基可W通過退火直接雜交到反轉(zhuǎn)錄得到 的第一鏈CDNA上。
[0016] 進(jìn)一步地，上述雙鏈接頭兩條鏈的序列分別為：
[0017] 5，-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3，；5，-AGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGT-3 '。
[0018] 可選地，上述雙鏈接頭中與測序引物堿基序列中的一部分相同的堿基序列可W增 加或減少。
[0019] 另一方面，本發(fā)明還提供的一種基于高通量測序的研究與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA的 方法，包括W下步驟：
[0020] 1)通過RNA免疫沉淀將獲得與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈CDNA;其中，該反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物包括形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列W及隨機(jī) 堿基序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的堿基序列包括用于識別RNA鏈信息的條碼堿基序列和與測序引 物部分相同的堿基序列；
[0021] 2)通過鏈置換方法引入已知序列，隨后引入測序引物；其中，鏈置換方法即為常 規(guī)使用的方法，通過鏈置換引物在3'端含有dG，與富含dC尾的第一鏈CDNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄酶 可W轉(zhuǎn)換模板繼續(xù)合成至鏈置換引物結(jié)束。W上述兩端都具有已知序列的第一鏈CDNA為 模板，合成第二鏈，然后在DM上加上測序接頭，從而形成適用于測序的文庫，可用于高通 量測序。
[0022] 進(jìn)一步地，在所述步驟1)之后，不通過連置換方法引入已知序列，而是可W利用 酶消化過量的反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物，并堿解與第一鏈CDNA雜合的RNA ;再利用雙鏈接頭與第一 鏈CDNA退火雜交，引入已知序列，隨后引入測序引物，其中，雙鏈接頭的一條鏈包括與測序 引物堿基序列中的一部分相同的堿基序列，并且，相對于另一條鏈，在3'端具有突出的堿基 序列，該突出的堿基序列為隨機(jī)堿基序列。由于是通過退火雜交雙鏈接頭引入已知序列，并 通過PCR的方法引入測序引物，因此，相比于常規(guī)的引入測序引物的方法，避免了割膠回收 的步驟，因此，減少了樣品的損失。眾所周知，利用RIP方法沉淀下來的RNA量較少，一般只 有幾十納克，而割膠回收步驟損失樣品較多，運會導(dǎo)致后續(xù)步驟中所需PCR循環(huán)數(shù)增多而 引入偏好性，甚至更嚴(yán)重的會導(dǎo)致PCR失敗。
[0023] 進(jìn)一步地，該反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物的序列為：
[0024] 5' -GTGCTCTTCCGATCTAGAGCANNNNNNNNN-3,；
[0025] 其中，所述雙鏈接頭兩條鏈的序列分別為：
[0026] 5，-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3，；5，-AGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGT-3'。
[0027] 上述方法通過反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物中的條碼堿基和發(fā)卡結(jié)構(gòu)來降低偏好性，并通過條 碼堿基來提高鏈信息判斷的準(zhǔn)確性，并且，該方法步驟較少，尤其是純化步驟減少，所W也 降低了過程中的損耗，進(jìn)一步降低了偏好性。
[0028] W下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，W 充分地了解本發(fā)明