一種從銀耳廢菌包中提取木聚糖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種從銀耳廢菌包中提取木聚糖酶的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖酶是一組降解木聚糖的酶，其具有很大的應(yīng)用前景，已被廣泛應(yīng)用于制漿 和造紙、醫(yī)藥和化工、紡織、食品、能源、環(huán)保、釀酒與飼料等各行各業(yè)。目前，許多諸如來 源于曲霉、木霉和芽抱桿菌的木聚糖酶已被成功商業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)有研究中，產(chǎn)木聚糖酶活 力較高的微生物主要有，細(xì)菌里的中度嗜鹽菌AX2000 aica知公知7化？AX2000)， 它產(chǎn)生的木聚糖酶活性高達(dá)25000U/mg;放線菌里的橄攬綠鏈霉菌Al,它產(chǎn)生的木聚糖 酶活性高達(dá)15000U/mL;真菌里的青霉菌化16 曲OCC九anisPole)和黑曲霉 BCC14405Us/?ei^77ywf如rBCC14405)，它們產(chǎn)生的木聚糖酶活性分別為8549. 85和 8007U/mg。在木聚糖酶產(chǎn)量方面，真菌與細(xì)菌相比具有明顯的優(yōu)勢。但是真菌中青霉菌和黑 曲霉在產(chǎn)木聚糖過程中常常會伴隨著毒素的產(chǎn)生，使木聚糖酶在應(yīng)用上具有一定的隱患。
[0003] 銀耳（又稱作白木耳、雪耳、銀耳子等，屬于真菌類銀耳科銀耳屬，是口 擔(dān)子菌口真菌銀耳的子實(shí)體，有"菌中之冠"的美稱。銀耳子實(shí)體純白至乳白色，直徑5~ 10厘米，柔軟潔白，半透明，富有彈性。具有強(qiáng)精、補(bǔ)腎、潤肺、生津、止咳、清熱、養(yǎng)胃、補(bǔ)氣、 和血、強(qiáng)屯、、壯身、補(bǔ)腦、提神的功效。目前已經(jīng)開發(fā)了銀耳糖漿、口服液等產(chǎn)品，取得了良好 的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 由于銀耳功效明顯，口感良好被消費(fèi)者廣泛接受。每年的產(chǎn)量與銷量節(jié)節(jié)升高，已 經(jīng)成為食用菌市場的主要產(chǎn)品之一。但是銀耳采摘完后會伴隨著大量廢棄培養(yǎng)料的產(chǎn)生， 古田縣是銀耳主產(chǎn)區(qū)，年生產(chǎn)銀耳2億袋W上，每年有10萬噸的廢菌慷。而從目前情況來 看，我國對銀耳菌渣的處理多是用做燃料或隨意丟棄，運(yùn)不但浪費(fèi)了寶貴的生物資源，同時(shí) 也帶來了嚴(yán)峻的環(huán)境問題。因此，如何有效開發(fā)和合理利用銀耳菌渣資源，是銀耳行業(yè)亟待 解決的問題。 陽0化]通過研究表明，銀耳在栽培過程中會產(chǎn)生大量的栽培料降解酶，其中木聚糖酶活 力最高，可達(dá)200U/g(鮮料)，具有很大的提取和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明通過對銀耳廢菌包中木 聚糖酶的提取、分離與純化，可將木聚糖酶比活力成功提高至8091U/mg，運(yùn)不僅在很大程度 上實(shí)現(xiàn)了銀耳廢菌包的循環(huán)再利用，也擴(kuò)展了木聚糖酶的來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種從銀耳廢菌包中提取木聚糖酶的方法，其不僅可在很 大程度上實(shí)現(xiàn)銀耳廢菌包的循環(huán)再利用，減少資源浪費(fèi)，也擴(kuò)展了木聚糖酶的來源，具有較 好推廣價(jià)值。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種從銀耳廢菌包中提取木聚糖酶的方法，是將銀耳廢菌包加水提取后，利用硫酸錠 對提取液進(jìn)行鹽析，再經(jīng)透析除鹽后利用DEAE-纖維素柱層析進(jìn)行純化，得木聚糖酶。
[0008] 其具體操作包括W下步驟： 1) 粗酶液的提?。簩偛赏赉y耳的廢菌包倒入不誘鋼鍋中，充分混勻后按料液比1:5 加水，于25°C、150巧m搖床上放置浸提2-化，用八層紗布過濾去渣后，將濾液于25°C離屯、機(jī) 中10000巧m離屯、20min，取上清液； 2) 鹽析與透析：將步驟1)所得上清液裝入=角瓶中，加硫酸錠調(diào)整至其飽和度為50%， 于25°C、150巧m搖床上放置2-化后，25°C下1000化pm離屯、20min，再取上清液加硫酸錠調(diào) 整至其飽和度為80%，于25°C、150巧m搖床上放置2-化后，25°C下10000巧m離屯、20min，所 得沉淀用憐酸緩沖液懸浮溶解，經(jīng)透析去鹽得粗酶液； 3)DEAE-纖維素柱層析純化：柱色譜參數(shù)：上樣量：2mL，柱子規(guī)格：50cmX2cm,柱體積 100血，W50mMTris-肥L(P冊.5)與化Cl(0-0. 5M)混合作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫 劑流速為0. 475mL/min;按每0. 95mL收集一管，測定每管收集液中蛋白濃度及木聚糖酶活 力，然后根據(jù)酶活力曲線與蛋白變化曲線，合并酶活力高且無蛋白的部分，濃縮后即得所述 木聚糖酶；每克銀耳廢菌包中提取得到的木聚糖酶的酶活力達(dá)130-140U，木聚糖酶的比活 力達(dá) 8〇9lU/mg。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：目前市場上大部分木聚糖酶來源于細(xì)菌發(fā)酵，但是細(xì)菌在發(fā) 酵過程中往往會產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，運(yùn)使木聚糖酶在使用上，特別是食品方面的使用存在 極大的隱患。申請人通過研究發(fā)現(xiàn)，銀耳在栽培過程中會產(chǎn)生大量的栽培料降解酶，其中木 聚糖酶活力最高。由此，本發(fā)明提供一種從銀耳廢菌包中提取木聚糖酶的方法，其鹽析后的 粗酶具有較高的安全性，即可用于食品生產(chǎn)、飼料添加等方面，而進(jìn)一步純化后的木聚糖酶 具有很高的純度，可作為試劑使用。
[0010] 本發(fā)明原料來源廣泛、廉價(jià)，提取方法簡單，實(shí)施可行性高，便于機(jī)械化和標(biāo)準(zhǔn)化 加工，不僅可在很大程度上實(shí)現(xiàn)銀耳廢菌包的循環(huán)再利用，減少資源浪費(fèi)，也擴(kuò)展了木聚糖 酶的來源，具有較好推廣價(jià)值。
【附圖說明】
[0011] 圖1為不同硫酸錠飽和度下木聚糖酶的活力測定結(jié)果。
[0012] 圖2為DEAE-纖維素柱層析純化過程中蛋白濃度與酶活力隨時(shí)間變化的曲線。
[0013] 圖3為SDS-PAGE蛋白電泳圖，其中A為Maker、B為純化收集液、C為粗酶液。
[0014]圖4為粗酶液對甘薦渣、教皮、廢報(bào)紙、廢紙箱、棉巧殼的降解情況。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0016] 實(shí)施例1 (1)粗酶液的提取 將剛采完銀耳的廢菌包倒入不誘鋼鍋中，充分混勻后按料液比1:5加水，于25°C、 150巧m搖床上放置浸提化，用八層紗布過濾去渣后，將濾液于25°C離屯、機(jī)中1000化pm離屯、 20min，取上清液； (2 )硫酸錠沉淀初始濃度和終濃度的確定 取步驟（1)所得上清液9份，每份IOOmU分別裝入250mL=角瓶中，然后按照硫酸錠飽 和度表，依次加硫酸錠配制成飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的 溶液，然后于25°C、150巧m搖床上放置化，離屯、，測定上清液中木聚糖酶的活力，W確定硫 酸錠沉淀的初始濃度與終濃度； 圖1為不同硫酸錠飽和度下木聚糖酶的活力測定結(jié)果。由圖1可得，隨著硫酸錠飽和 度的提高，上清液中的木聚糖酶活力逐漸降低，硫酸錠飽和度為50%前，硫酸錠飽和度的提 高對上清液中木聚糖酶活力的影響較低，到硫酸錠飽和度為50%后，隨著硫酸錠飽和度的 繼續(xù)提高，上清液中木聚糖酶活力快速降低，至飽和度為80%后，上清液中木聚糖酶的活力 不到原始的5%，而繼續(xù)提高硫酸錠飽和度，酶活力未有太大變化。因此，將硫酸錠沉淀的最 佳初始飽和度定為50%，最佳終飽和度定為80%。
[0017] (3)鹽析與透析 取步驟（1)所得上清液500血，裝入ILS角瓶中，加硫酸錠調(diào)整至其