106個(gè)/孔）后的第二天開始。實(shí)驗(yàn)開始前3天進(jìn)行待測(cè)芽孢桿菌HZC58菌株培養(yǎng)， 取出菌液1. 5mL測(cè)0D_值，調(diào)整待測(cè)菌株達(dá)到0D值為1，按感染復(fù)數(shù)（M0I)為1 :40取出 300yL菌液于滅菌離心管中，8000g離心2分鐘，輕輕吸取菌液培養(yǎng)上清100yL、棄去剩余 培養(yǎng)液上清，將剩余菌體以及菌液培養(yǎng)上清100yL加入到200yL細(xì)胞培養(yǎng)基中，混勻（細(xì) 胞培養(yǎng)基含有熱滅活胎牛血清、雙抗）使菌體-菌體上清-細(xì)胞培養(yǎng)基混合液終濃度為含 有2%熱滅活胎牛血清和1%。雙抗。將長(zhǎng)滿細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)液吸去，注意一定要輕柔 保證細(xì)胞數(shù)量一致，每孔加入100yL待測(cè)菌株的細(xì)菌培養(yǎng)上清與細(xì)胞培養(yǎng)基混合液（對(duì)照 組加入100yLPBS與細(xì)胞培養(yǎng)基混合液），同時(shí)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中按1 :1000加入IHNV病 毒液（效價(jià)為l〇s'5TCID5。）。共培養(yǎng)于含有15°C、3%C02條件下共培養(yǎng)24h，分別吸取試驗(yàn) 組和對(duì)照組的培養(yǎng)上清，測(cè)定TCID5。值，進(jìn)行比較。
[0054] (2)結(jié)果表明：芽孢桿菌HZC58菌株相互作用實(shí)驗(yàn)組，病毒效價(jià)為10〃TCID5。，對(duì)照 組為l(f5TCID5。，統(tǒng)計(jì)分析表明差異極顯著（P< 0. 01)(見圖4)。表明芽孢桿菌HZC58菌 株與EPC細(xì)胞（魚上皮細(xì)胞）共培養(yǎng)后可以阻止病毒的增殖，具有體外抗病毒（IHNV)的特 性。
[0055] 實(shí)施例5本發(fā)明芽孢桿菌HZC58菌株的免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能的特性研究
[0056] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芽孢桿菌HZC58菌株對(duì)冷水魚的免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能的特性。
[0057] 6. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0058] 選用虹鱒魚平均體重為20g幼魚，試驗(yàn)前一個(gè)月分組飼養(yǎng)于15°C恒溫供氧循環(huán)水 族箱中，每一單獨(dú)水槽中50尾。
[0059] 6. 2實(shí)驗(yàn)方法：
[0060] 試驗(yàn)開始前，對(duì)益生候選菌株芽孢桿菌HZC58進(jìn)行復(fù)壯及傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)前2天 進(jìn)行1 : 1〇〇轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，待菌株達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)取出菌液測(cè)〇D6。。值。虹鱒粉狀飼料與菌液，使 用小型顆粒飼料機(jī)制成包被顆粒飼料，制備好的包被飼料在20°C鼓風(fēng)恒溫培養(yǎng)箱中輕微干 燥。每組魚飼喂含菌2X107cfu/g的顆粒飼料（每日飼喂含菌飼料20g/50尾），同時(shí)設(shè)置平 行對(duì)照組1組（每日飼喂正常飼料20g/50尾），每組均為50尾。每日記錄采食量、及精神 狀態(tài)等，連續(xù)飼喂一周后，無菌采集頭腎及部分中腎和脾臟分別在置于滅菌的一次性EP管 中（管中帶有3個(gè)滅菌鋼珠），立即用振蕩器將組織研磨粉碎，立即10000g相對(duì)離心力離心 2分鐘，立即取上清及采集的血清分別用魚IL-lPkit、魚腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA、 魚SOD、魚IgMkit、魚總補(bǔ)體（ACH50)ELISA試劑盒進(jìn)行虹鱒魚IL-1 0、TNF-a、魚SOD、魚 總補(bǔ)體ACH50的絕對(duì)含量測(cè)定。并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0061] 6.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0062] 結(jié)果表明：飼喂組采食量和精神狀態(tài)與對(duì)照組無差別，采食量均正常（均在2分鐘 內(nèi)全部搶食完），精神狀態(tài)均良好；實(shí)驗(yàn)組脾臟的IL-1 0含量極顯著高于對(duì)照組，差異極顯 著（P< 0.0001);實(shí)驗(yàn)組血清的TNF-a含量、IL-1P含量、IgM含量極顯著高于對(duì)照組，差 異極顯著（P< 0.0001);實(shí)驗(yàn)組血清的總補(bǔ)體ACH50、S0D含量均顯著高于對(duì)照組，差異極 顯著（P< 0. 01)(見圖5)。結(jié)果表明芽孢桿菌HZC58菌株對(duì)冷水魚具有極好的免疫調(diào)節(jié)和 增強(qiáng)免疫功能的特性。
[0063] 實(shí)施例6本發(fā)明芽孢桿菌HZC58菌株對(duì)冷水魚的抗病毒特性研究
[0064] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證芽孢桿菌HZC58新菌株對(duì)冷水魚的抗病毒特性。
[0065] 7. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0066] 選用虹鱒魚平均體重為20g幼魚，試驗(yàn)前一個(gè)月分組飼養(yǎng)于15°C恒溫供氧循環(huán)水 族箱中，每一單獨(dú)水槽中50尾。
[0067] 7. 2實(shí)驗(yàn)方法：
[0068] 試驗(yàn)開始前，益生候選菌株芽孢桿菌HZC58進(jìn)行復(fù)壯及傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)前2天 進(jìn)行1 :1〇〇轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，待菌株達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)取出菌液測(cè)〇D6。。值。使所取菌懸液細(xì)菌達(dá)到 2X107CFU/mL。虹鱒粉狀飼料與菌液，使用小型顆粒飼料機(jī)制成包被顆粒飼料，制備好的包 被飼料在20°C鼓風(fēng)恒溫培養(yǎng)箱中輕微干燥。每組魚飼喂含菌2X107cfu/g的顆粒飼料（每 日飼喂含菌飼料20g/50尾，每日現(xiàn)用現(xiàn)配），同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照組1組（每日飼喂正常飼 料20g/50尾），每組均為50尾。每日記錄采食量、及精神狀態(tài)等，連續(xù)飼喂一周后，進(jìn)行攻 毒（魚傳染性造血器官壞死病病毒IHNV)，攻毒當(dāng)天禁食一天，各試驗(yàn)組中隨機(jī)取出40尾試 驗(yàn)魚，使用MS-222將試驗(yàn)魚分批浸泡麻醉，立即用8個(gè)LD50劑量的IHNV病毒液進(jìn)行背鰭 注射攻毒，100yL/尾。攻毒后連續(xù)觀察23d，統(tǒng)計(jì)各組的累計(jì)死亡數(shù)，并計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù) 率（RelativePercentSurvival，RPS):RPS= (1-MiMc)X100%，公式中：Mi為免疫組死 亡率；Me為對(duì)照組死亡率。
[0069] 7.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070] 結(jié)果表明：飼喂芽孢桿菌HZC58新菌株的實(shí)驗(yàn)組可以使冷水魚虹鱒得到20. 0%的 攻毒保護(hù)，而對(duì)照組100%死亡。結(jié)果見表2。
[0071] 表 2
[0072]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株冷水魚益生菌芽孢桿菌（Bacilussp.)菌株，命名為HZC58,微生物保藏號(hào)為 CGMCC No. 10706,保藏日期為2015年4月9日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心。2. 權(quán)利要求1所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株在制備冷水魚飼料添加劑中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株在制備冷水魚抗傳染性造血器官壞 死病病毒疫苗制劑中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株單獨(dú) 使用或與冷水魚飼料、冷水魚疫苗聯(lián)合使用。5. 權(quán)利要求1所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株在制備冷水魚疫苗免疫調(diào)節(jié)劑或免 疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的冷水魚疫苗免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增 強(qiáng)劑是通過提高冷水魚IL-I P、TNF-a、IgM、總補(bǔ)體ACH50以及SOD的水平進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié) 或增強(qiáng)冷水魚免疫功能的目的。7. 權(quán)利要求1所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株在制備冷水魚活載體疫苗中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株作為 外源蛋白分泌表達(dá)的活載體宿主菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株冷水魚益生菌芽孢桿菌菌株及其用途。本發(fā)明從遼寧省本溪山區(qū)半野生虹鱒幼魚的腸道黏膜中分離鑒定了一株對(duì)冷水魚具有抗病毒特性以及免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能特性的菌株：HZC58。根據(jù)菌落的形態(tài)特征觀察及16SrDNA堿基序列測(cè)定和同源性分析，對(duì)該菌株鑒定結(jié)果為：HZC58屬于芽孢桿菌，保藏編號(hào)為：CGMCC？No.10706。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明：芽孢桿菌HZC58菌株與EPC細(xì)胞(魚上皮細(xì)胞)共培養(yǎng)，具有體外抗IHNV在EPC細(xì)胞增殖的特性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：芽孢桿菌HZC58菌株對(duì)冷水魚具有免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能的特性，且HZC58菌株單獨(dú)飼喂對(duì)冷水魚也具有抗IHNV感染的特性。由此可見：本發(fā)明的芽孢桿菌HZC58菌株在冷水魚抗病毒方面以及免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)冷水魚免疫功能方面有一定應(yīng)用前景。CGMCC No.1070620150409
【IPC分類】A61K39/205, A61K39/385, C12N1/20, A61P37/04, A61K39/39, A61P31/14, A23K1/18, A61P37/02, A61K35/742, A23K1/17, C12R1/07
【公開號(hào)】CN105132310
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510482736
【發(fā)明人】王云峰, 崔紅玉, 王笑梅
【申請(qǐng)人】哈爾濱動(dòng)物生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年8月7日