專利名稱：一種香蕉內(nèi)生菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物內(nèi)生放線菌——香蕉內(nèi)生鏈霉菌及其分離培養(yǎng)方法和用于香蕉促長與香蕉鐮孢菌(尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum)枯萎病防治的用途。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是能從經(jīng)過表面消毒的植物組織中分離或者從植物內(nèi)部的汁液中獲得，并且對(duì)植物表觀上無危害即不導(dǎo)致明顯病癥的微生物。植物內(nèi)生菌包括互惠共利的(mutualistic)和中性的(neutral)內(nèi)共生微生物。目前已經(jīng)從很多植物的各種器官(根、莖、葉、花、果實(shí)、種子)中分離到內(nèi)生菌。它們?cè)谥参矬w內(nèi)的普遍性、豐富的生物多樣性及功能多樣性已有不少文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。內(nèi)生菌經(jīng)過長期的與植物發(fā)生相互作用，它們之間形成較復(fù)雜的關(guān)系。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對(duì)宿主植物有以下幾個(gè)方面的作用1)促進(jìn)宿主植物生長，提高宿主的生產(chǎn)力，可增強(qiáng)宿主對(duì)病、蟲的抗性，因而在農(nóng)業(yè)生物控制、生物防治方面顯示了重要意義；2)增強(qiáng)宿主植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性。如對(duì)干旱、全球氣溫上升、鹽堿、重金屬及其它有毒物質(zhì)污染等的抗性；3)內(nèi)生菌產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)。植物內(nèi)生菌作為一種特殊生境的微生物，在植物體內(nèi)產(chǎn)生豐富多樣、具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物，目前人們已從內(nèi)生菌中找到許多具有各種生物活性的新物質(zhì)在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)方面顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值。
目前，國際上關(guān)于內(nèi)生放線菌的研究不多，更沒有開展香蕉內(nèi)生鏈霉菌用于抗香蕉枯萎病的試驗(yàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能防治香蕉鐮孢菌枯萎病的香蕉內(nèi)生菌及其分離培養(yǎng)方法和用于香蕉促長與香蕉鐮孢菌枯萎病防治的用途。
本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌是發(fā)明人從香蕉植株中分離到的一株放線菌，經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定和分子鑒定表明它屬于鏈霉菌，將其命名為鏈霉菌S96(Streptomyces roseogriseolus S96)。
本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌——鏈霉菌S96(Streptomyces roseogriseolus S96)已于2003年9月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M203070。
本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌——鏈霉菌S96(以下簡(jiǎn)稱為鏈霉菌CCTCC M203070)具有如下的生物學(xué)特征
1.菌落形態(tài)特征在S培養(yǎng)基上生長良好，放線菌菌落特征菌絲緊密，正面灰色，背面為瓜瓤粉色，產(chǎn)生落英淡粉色可溶性色素，孢子連接成直鏈狀，孢子數(shù)大于15個(gè)。
2.菌體形態(tài)特征細(xì)胞絲狀，菌絲直徑約為0.3-0.7μM，革蘭氏陽性。
3.主要生理生化特征可在放線菌培養(yǎng)基S上良好生長，生長溫度10-38℃，生長pH5-9；對(duì)尖孢鐮孢菌有明顯抑制活性，產(chǎn)生淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和纖維素酶。
4.遺傳學(xué)特征該鏈霉菌CCTCC M203070的16S rDNA部分基因序列(709bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Genbank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登錄號(hào)為AJ519793。根據(jù)《放線菌分類與鑒定》(閻遜初，科學(xué)出版社，1992)，本發(fā)明的鏈霉菌CCTCC M203070在形態(tài)特征上，與國內(nèi)命名的玫瑰淺灰鏈霉菌(Streptomycesroseogriseolus)最接近；該鏈霉菌CCTCC M203070的16S rDNA序列分析表明，與Genbank國際數(shù)據(jù)庫中記錄的最相似的菌株Streptomyces griseorubiginosus(AJ399488)的相似性為99％。因此，鏈霉菌CCTCC M203070應(yīng)屬于鏈霉菌屬。
本發(fā)明的鏈霉菌CCTCC M203070可通過如下方法從香蕉植株分離培養(yǎng)得到(1)將在香蕉枯萎病疫區(qū)采集的香蕉植株的根、莖或/和葉經(jīng)表面消毒處理后，剪為小塊，接種于S或改良的S培養(yǎng)基平板，于24～30℃下培養(yǎng)5～7天；(2)挑取小型菌絲緊密的放線菌特征菌落，于相同培養(yǎng)基平板劃線純化分離，置于24～30℃培養(yǎng)5～7天；(3)將所得純菌株與病原菌尖孢鐮孢菌作平板對(duì)峙試驗(yàn)，從中選擇對(duì)病原菌具抗性的菌株，通過香蕉苗接種試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其促長和抗病活性后，鑒定并保存菌種。
發(fā)明人已針對(duì)該鏈霉菌CCTCC M203070發(fā)展了一套培養(yǎng)技術(shù)，并能把該菌重新回接到香蕉組培苗，促進(jìn)了香蕉苗的生長、增強(qiáng)了香蕉對(duì)鐮刀菌枯萎病的抗性。
本發(fā)明的鏈霉菌CCTCC M203070的制種方法，其步驟包括(1)將鏈霉菌CCTCC M203070純菌種接種于S或改良S培養(yǎng)基斜面，在28℃培養(yǎng)至孢子豐滿，作為斜面種子；(2)將斜面種子接于種子培養(yǎng)基中，于25～29℃下以150～200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30-50小時(shí)，作為二級(jí)種子液；所述種子培養(yǎng)基為S或改良的S培養(yǎng)基，pH7.3；(3)在固態(tài)制種培養(yǎng)基按2～4％(體積/重量)接入二級(jí)種子液，28℃保溫培養(yǎng)至孢子豐滿；收獲孢子作為菌種；所述制種培養(yǎng)基成分組成為玉米粉150g，葡萄糖或蔗糖100g，黃豆餅粕粉150g，蛋白胨10g，酵母膏或酵母粉10g，碳酸鈣50g和水300ml。
本發(fā)明所述的S培養(yǎng)基成分組成通常為葡萄糖1.0g，蛋白胨4.0g，磷酸氫二甲鉀0.5g，硫酸鎂0.1g，氯化鈣0.1g，微量的檸檬酸鐵等(微量元素)，瓊脂2.0g，海水100ml，pH7.0～7.3；所述改良的S培養(yǎng)基通常是在S培養(yǎng)基基礎(chǔ)上以硝酸鉀1.0g代替蛋白胨。
本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌——鏈霉菌CCTCC M203070不僅能促進(jìn)香蕉生長，并可用于防治香蕉鐮孢菌(尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum)枯萎病。該鏈霉菌CCTCC M203070經(jīng)體內(nèi)外試驗(yàn)，均顯示了拮抗病原菌尖孢鐮孢菌古巴專化型的活性。在香蕉組織提取物培養(yǎng)基上的試驗(yàn)表明該菌的抗真菌活性可能與爭(zhēng)奪香蕉組織中的有效鐵有關(guān)。試驗(yàn)證明，應(yīng)用該香蕉內(nèi)生菌接種香蕉苗后，植株生長狀況改善，抗病性提高。
本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌用于促進(jìn)香蕉生長和防治香蕉鐮孢菌枯萎病時(shí)，只需將該香蕉內(nèi)生菌——鏈霉菌CCTCC M20307接種于香蕉苗，即可獲得促進(jìn)香蕉苗生長和提高其對(duì)香蕉鐮孢菌枯萎病抗病力的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1鏈霉菌CCTCC M203070的分離培養(yǎng)方法之一1.采集香蕉枯萎病疫區(qū)健康香蕉植株的根樣品，充分沖洗，70％乙醇處理5分鐘，次氯酸鈉(0.9％有效氯)溶液處理20分鐘，無菌水充分沖洗；2.將處理好的樣品剪碎，接入S平板中；3.該平板置于26℃培養(yǎng)5天；4.挑取小型菌絲緊密的放線菌特征菌落，于相同培養(yǎng)基平板劃線純化分離，置于24～30℃培養(yǎng)5天，挑取單菌落，接于相同培養(yǎng)基斜面保存。
5.將所得純菌株與病原菌尖孢鐮孢菌作平板對(duì)峙試驗(yàn)，從中選擇對(duì)病原菌具抗性的菌株，通過香蕉苗接種試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其促長和抗病活性后，鑒定并保存菌種。
實(shí)施例2鏈霉菌CCTCC M203070的分離培養(yǎng)方法之二1、采集香蕉枯萎病疫區(qū)健康香蕉植株的葉樣品，充分沖洗，36％甲醛處理30秒，次氯酸鈉(0.9％有效氯)溶液處理20分鐘，無菌水充分沖洗；2、將處理好的樣品剪碎，接入改良的S平板中；3、該平板置于26℃培養(yǎng)7天；4、挑取小型菌絲緊密的放線菌特征菌落，于相同培養(yǎng)基平板劃線純化分離，置于24～30℃培養(yǎng)5天，挑取單菌落，接于相同培養(yǎng)基斜面保存。
5、將所得純菌株與病原菌尖孢鐮孢菌作平板對(duì)峙試驗(yàn)，從中選擇對(duì)病原菌具抗性的菌株，通過香蕉苗接種試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其促長和抗病活性后，鑒定并保存菌種。
實(shí)施例3鏈霉菌CCTCC M203070的培養(yǎng)制種方法之一1.將實(shí)施例1或2得到的鏈霉菌CCTCC M203070純種接S培養(yǎng)基斜面；
2.28℃培養(yǎng)至孢子長滿；3.轉(zhuǎn)接相同培養(yǎng)基平板，于28℃培養(yǎng)至孢子長滿；孢子可直接應(yīng)用于接種香蕉或擴(kuò)大培養(yǎng)。
實(shí)施例4鏈霉菌CCTCC M203070的培養(yǎng)制種方法之二1.將實(shí)施例1或2得到的鏈霉菌CCTCC M203070純種接S培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)至孢子長滿；2.將斜面種子接于盛于500ml三角瓶的200ml種子培養(yǎng)基中，于28℃以200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，即為二級(jí)種子液；3.三角瓶?jī)?nèi)裝約五分之一滅菌的固態(tài)制種培養(yǎng)基，按2～4％(V/W)接入二級(jí)種子液，混均，28℃保溫培養(yǎng)至孢子長滿，獲得的孢子可用于接種香蕉。
所述制種培養(yǎng)基為玉米粉150g，葡萄糖(或蔗糖)100g，黃豆餅粕粉150g，蛋白胨10g，酵母膏或酵母粉10g，碳酸鈣50g，水約300ml。
實(shí)施例5按照實(shí)施例4的方法，其步驟3中的“三角瓶?jī)?nèi)裝約五分之一滅菌的固態(tài)制種培養(yǎng)基”改為“瓷盤內(nèi)裝一層約三厘米厚的滅菌固態(tài)制種培養(yǎng)基”，其它步驟和條件與實(shí)施例4相同。
實(shí)施例6鏈霉菌CCTCC M203070應(yīng)用于抗香蕉枯萎病病原菌的試驗(yàn)1.鏈霉菌CCTCC M203070純種接S培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)至孢子長滿；2..用無菌水洗下斜面內(nèi)生菌孢子，接種于香蕉假莖條塊(約3厘米)A的一端，并培養(yǎng)至孢子在假莖上生長形成可見菌落；3..緊接著把病原真菌尖孢鐮孢菌接種于香蕉假莖條塊B的一端和假莖塊A的無接種鏈霉菌CCTCC M203070的一端，28℃培養(yǎng)5天；4..用肉眼直接觀察和采用乳酸酚藍(lán)染色后用顯微鏡觀察香蕉假莖條塊上病原真菌的生長，判斷內(nèi)生菌對(duì)致病真菌生長的影響；5..結(jié)果不接鏈霉菌CCTCC M203070的假莖塊B很快長滿致病真菌菌絲，而假莖塊A僅有二分一受致病真菌菌絲侵犯，接了鏈霉菌CCTCC M203070的一端看不到致病真菌菌絲；以乳酸酚蘭染色后，顯微觀察也發(fā)現(xiàn)接近鏈霉菌CCTCC M203070的莖組織很少致病真菌菌絲生長。
實(shí)施例7鏈霉菌CCTCC M203070應(yīng)用于抗香蕉枯萎病的試驗(yàn)
1.鏈霉菌CCTCC M203070純種接S培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)至孢子長滿；2.將斜面種子接于盛于500ml三角瓶的200ml種子培養(yǎng)基中，于28℃以200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)約30小時(shí)，即為二級(jí)種子液；3.三角瓶?jī)?nèi)裝約五分之一滅菌的固態(tài)制種培養(yǎng)基，按2～4％接入二級(jí)種子液，混均，28℃保溫培養(yǎng)至孢子長滿；4.以上述鏈霉菌CCTCC M203070種子培養(yǎng)物接種香蕉組培苗20株，組培苗轉(zhuǎn)移至花盆后移至溫室，一個(gè)月后可見接了鏈霉菌CCTCC M203070的香蕉苗生長狀況、植株高度和葉面面積都明顯優(yōu)于對(duì)照組；5.香蕉苗移植后45天，進(jìn)行人工感染致病性尖孢鐮刀菌，兩個(gè)月后，不接鏈霉菌CCTCC M203070的對(duì)照組100％香蕉苗出現(xiàn)黃葉和漸漸枯萎，接種了鏈霉菌CCTCC M203070的試驗(yàn)組香蕉苗長勢(shì)良好，100％無枯萎病癥狀出現(xiàn)；實(shí)施例8鏈霉菌CCTCC M203070對(duì)香蕉生長影響的擴(kuò)大試驗(yàn)1.鏈霉菌CCTCC M203070純種接S培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)至孢子長滿；1.將斜面種子接于盛于500ml三角瓶的200ml種子培養(yǎng)基中，于28℃以200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，即為二級(jí)種子液；2.三角瓶?jī)?nèi)裝約五分之一滅菌的固態(tài)制種培養(yǎng)基，按2～4％接入二級(jí)種子液，混均，28℃保溫培養(yǎng)至孢子長滿；3.以上述鏈霉菌CCTCC M203070種子培養(yǎng)物接種香蕉組培苗100株，組培苗然后移植至苗圃，兩個(gè)月后可見接種鏈霉菌CCTCC M203070的香蕉苗生長狀況明顯優(yōu)于對(duì)照組，植株高度和葉面面積比對(duì)照組增加約三分之一。
權(quán)利要求
1.一種香蕉內(nèi)生菌，其特征在于該菌是鏈霉菌CCTCC M203070。
2.按照權(quán)利要求1所述的香蕉內(nèi)生菌，其特征是該菌是從香蕉植株分離培養(yǎng)得到的。
3.按照權(quán)利要求2所述的香蕉內(nèi)生菌，其特征在于該菌是通過如下方法從香蕉植株分離培養(yǎng)得到的(1)將在香蕉枯萎病疫區(qū)采集的香蕉植株的根、莖或/和葉經(jīng)表面消毒處理后，剪為小塊，接種于S或改良的S培養(yǎng)基平板，于24～30℃下培養(yǎng)5～7天；(2)挑取小型菌絲緊密的放線菌特征菌落，于相同培養(yǎng)基平板劃線純化分離，置于24～30℃培養(yǎng)5～7天；(3)將所得純菌株與病原菌尖孢鐮孢菌作平板對(duì)峙試驗(yàn)，從中選擇對(duì)病原菌具抗性的菌株，通過香蕉苗接種試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其促長和抗病活性后，鑒定并保存菌種。
4.按照權(quán)利要求3所述的香蕉內(nèi)生菌，其特征在于所述的改良的S培養(yǎng)基是在S培養(yǎng)基基礎(chǔ)上以1.0g硝酸鉀代替蛋白胨。
5.權(quán)利要求1所述的香蕉內(nèi)生菌的制種方法，其步驟包括(1)將鏈霉菌CCTCC M203070純菌種接種于S或改良S培養(yǎng)基斜面，在28℃培養(yǎng)至孢子豐滿，作為斜面種子；所述改良的S培養(yǎng)基是在S培養(yǎng)基基礎(chǔ)上以硝酸鉀1.0g代替蛋白胨；(2)將斜面種子接于種子培養(yǎng)基中，于25～29℃下以150～200r/m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30-50小時(shí)，作為二級(jí)種子液；所述種子培養(yǎng)基為S或改良的S培養(yǎng)基，pH7.3；(3)在固態(tài)制種培養(yǎng)基按2～4％的體積/重量比接入二級(jí)種子液，28℃保溫培養(yǎng)至孢子豐滿；收獲孢子作為菌種；所述制種培養(yǎng)基成分組成為玉米粉150g，葡萄糖或蔗糖100g，黃豆餅粕粉150g，蛋白胨10g，酵母膏或酵母粉10g，碳酸鈣50g和水300ml。
6.權(quán)利要求1所述的香蕉內(nèi)生菌用于防治香蕉鐮孢菌枯萎病的用途。
7.按照權(quán)利要求6所述的用途，其特征是利用鏈霉菌CCTCC M203070接種于香蕉苗，獲得對(duì)鐮孢菌枯萎病具有抗病力的香蕉植株。
8.權(quán)利要求1所述的香蕉內(nèi)生菌用于香蕉促長的用途。
9.按照權(quán)利要求8所述的用途，其特征是利用鏈霉菌CCTCC M203070接種于香蕉苗，促進(jìn)香蕉苗生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香蕉內(nèi)生鏈霉菌及其分離培養(yǎng)方法和用于香蕉促長與香蕉鐮孢菌枯萎病防治的用途。本發(fā)明的香蕉內(nèi)生菌為鏈霉菌CCTCC M203070。該鏈霉菌CCTCC M203070可從香蕉枯萎病疫區(qū)的香蕉植株分離培養(yǎng)得到。試驗(yàn)結(jié)果表明，該鏈霉菌CCTCC M203070具有促進(jìn)香蕉苗生長和提高對(duì)鐮孢菌枯萎病抗性的作用，可用于促進(jìn)香蕉生長和防治香蕉鐮孢菌枯萎病。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1637133SQ20041005259
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者周世寧, 曹理想 申請(qǐng)人:中山大學(xué)