專(zhuān)利名稱(chēng)：制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的新方法。
背景技術(shù)：
對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸是半合成β-內(nèi)酰胺抗生素的重要側(cè)鏈，用于合成羥氨芐青霉素、頭孢羥氨芐、頭孢哌酮、頭孢羅奇以及頭孢羥胺唑等。目前對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)國(guó)內(nèi)外大都采用如下兩種方法一種是用對(duì)氧基苯甲酸法、對(duì)羥基苯甲醛法或乙醛酸法合成外消旋對(duì)羥基苯甘氨酸，然后對(duì)外消旋體進(jìn)行拆分；其中外消旋體的合成工藝成熟，外消旋體的拆分為技術(shù)難度大的關(guān)鍵步驟。迄今，拆分對(duì)羥基苯甘氨酸的方法有化學(xué)法、誘導(dǎo)結(jié)晶法和酶法，其中化學(xué)法和結(jié)晶法有步驟多，成本高、收率低等弊端，酶法因其反應(yīng)條件溫和、高效、高選擇性及成本低而頗受青睞；另一種方法是用海因酶催化對(duì)羥基苯海因開(kāi)環(huán)水解成N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸，后者經(jīng)亞硝酸水解成相應(yīng)的對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸。該法已被廣泛采用，所用的酶價(jià)格昂貴，且亞硝酸的使用帶來(lái)較嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。因此，研究開(kāi)發(fā)對(duì)羥基苯甘氨酸拆分新工藝具有重大的實(shí)踐意義。
近年來(lái)，離子液替代易造成環(huán)境污染的有機(jī)溶劑作為新興的綠色反應(yīng)介質(zhì)已成為研究的熱點(diǎn)。離子液具有可忽略的蒸氣壓、高穩(wěn)定性，可溶解許多極性或非極性的有機(jī)、無(wú)機(jī)化合物，易于與其它物質(zhì)分離，可循環(huán)利用等優(yōu)良特性。研究結(jié)果表明，許多酶如蛋白酶、脂肪酶在離子液中具有較高的催化活性、選擇性及穩(wěn)定性(Trends Biotechnol.2003，21131-138)。因此，離子液作為反應(yīng)介質(zhì)用于有機(jī)合成、生物催化與生物合成等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)工藝存在的問(wèn)題，提供一種離子液中酶促對(duì)羥基苯甘氨酸酯不對(duì)稱(chēng)水解的方法，利用木瓜蛋白酶催化對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯的高效不對(duì)稱(chēng)水解制備高對(duì)映體純度的對(duì)羥基苯甘氨酸，該方法使用離子液1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(BMIM·BF4，可與水相混溶)和磷酸緩沖液的混合體系作反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)環(huán)境污染小，易從反應(yīng)混合體系中方便地分離出產(chǎn)物。由于離子液具有可忽略的蒸氣壓，在減壓的條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，可在線分離出副產(chǎn)物甲醇，提高對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率和對(duì)映體純度。
本發(fā)明的制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，包括如下步驟(1)在反應(yīng)器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩沖液(pH7.0，50mmol/L)、對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-40％，底物對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯濃度為50-500mmol/L，酶量為120-840Units；(2)在溫度為25-60℃、振蕩速度為130-220rev./min、常壓-0.04MPa下反應(yīng)22-36小時(shí)后，超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸。
本發(fā)明的較佳方案包括如下步驟(1)在反應(yīng)器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩沖液(pH7.0，50mmol/L)、對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-20％，底物對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯濃度為100-400mmol/L，酶量為360-840Units；(2)在溫度為40-60℃、振蕩速度為160-200rev./min、常壓-0.6MPa)下反應(yīng)24-32小時(shí)后，超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸。
最佳方案是將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h。分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率高達(dá)49.8％，對(duì)映體純度高達(dá)98％。
所述分離產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法可以是常規(guī)的分離方法。發(fā)明人經(jīng)過(guò)探索性試驗(yàn)，提供的分離產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法包括如下步驟——加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應(yīng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對(duì)羥基苯甘氨酸；——加入濃鹽酸(8.0mol/L)于離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數(shù)分鐘后，產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸沉淀下來(lái)，過(guò)濾、干燥，就可獲得對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單易控、產(chǎn)物易分離；反應(yīng)體系中木瓜蛋白酶的催化活性、對(duì)映體選擇性及穩(wěn)定性均很高；在減壓條件下，L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率49％以上，對(duì)映體純度98％以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將4ml含0％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.4mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應(yīng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對(duì)羥基苯甘氨酸；加入濃鹽酸(8.0mol/L)于離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數(shù)分鐘后，產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸沉淀，過(guò)濾、干燥獲得對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率38.5％，對(duì)映體純度95％。
實(shí)施例2將4ml含10％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.4mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率44.7％，對(duì)映體純度95.1％。
實(shí)施例3將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.4mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率47.2％，對(duì)映體純度95.7％。
實(shí)施例4將4ml含15％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.4mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率45.7％，對(duì)映體純度92.9％。
實(shí)施例5將4ml含20％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入1.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，壓力為0.6MPa下，置于60℃、200rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)32h后，加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應(yīng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對(duì)羥基苯甘氨酸；加入濃鹽酸(8.0mol/L)于離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數(shù)分鐘后，產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸沉淀下來(lái)，過(guò)濾、干燥獲得對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率43.8％，對(duì)映體純度92.4％。
實(shí)施例6將4ml含40％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，在常壓下，然后加入0.4mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率18.6％，對(duì)映體純度56.3％。
實(shí)施例7將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.2mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)32h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率46.5％，對(duì)映體純度95.3％。
實(shí)施例8將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率47.9％，對(duì)映體純度96.2％。
實(shí)施例9將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.8mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)30h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率45％，對(duì)映體純度93.6％。
實(shí)施例10將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入2.0mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和300mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)36h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率17.3％，對(duì)映體純度80.2％。
實(shí)施例11將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和100mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率18.4％，對(duì)映體純度96.3％。
實(shí)施例12將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率47.9％，對(duì)映體純度96.6％。
實(shí)施例13將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和700mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率48.1％，對(duì)映體純度96.1％。
實(shí)施例14將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于25℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)36h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率47.5％，對(duì)映體純度95.6％。
實(shí)施例15將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于45℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率48.4％，對(duì)映體純度96.9％。
實(shí)施例16將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于60℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)22h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率35.2％，對(duì)映體純度83.3％。
實(shí)施例17將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、130rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率45.0％，對(duì)映體純度95.4％。
實(shí)施例18將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在常壓下，置于40℃、220rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率47.3％，對(duì)映體純度96.4％。
實(shí)施例19將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸的產(chǎn)率49.8％，對(duì)映體純度98％。
權(quán)利要求
1.一種制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1)在反應(yīng)器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩沖液(pH7.0，50mmol/L)、對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-40％，底物對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯濃度為50-500mmol/L，酶量為120-840Units；(2)在溫度為25-60℃、振蕩速度為130-220rev./min、常壓-0.04MPa下反應(yīng)22-36小時(shí)后，超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1)在反應(yīng)器中依次加入離子液BMIM·BF4、磷酸緩沖液(pH7.0，50mmol/L)、對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯、木瓜蛋白酶；離子液在混合體系中的含量為0-20％，底物對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯濃度為100-400mmol/L，酶量為360-840Units；(2)在溫度為40-60℃、振蕩速度為160-200rev./min、常壓-0.6MPa)下反應(yīng)24-32小時(shí)后，超濾除掉反應(yīng)混合物中的懸浮顆粒和酶，分離得到產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于分離產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法包括如下步驟——加入乙酸乙酯，萃取殘留的未反應(yīng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯，真空蒸餾，在NaOH(1.0mol/L)水溶液中水解成D-對(duì)羥基苯甘氨酸；——加入濃鹽酸(8.0mol/L)于離子液/水混合體系中，pH值降至2.0左右，振蕩數(shù)分鐘后，產(chǎn)物L(fēng)-對(duì)羥基苯甘氨酸沉淀下來(lái)，過(guò)濾、干燥就可獲得對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于將4ml含12.5％(v/v)離子液BMIM·BF4/磷酸緩沖液(50mmol/L，pH7.0)混合體系裝入具塞的三角瓶中混合均勻，然后加入0.6mmol對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和500mg木瓜蛋白酶(1.2units/mg)，在減壓條件下(壓力約0.04MPa)，置于45℃、160rev./min的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)24h后，分離獲得L-對(duì)羥基苯甘氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備對(duì)映體純對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，包括在反應(yīng)器中依次加入離子液BMIM·BF
文檔編號(hào)C12P13/04GK1693471SQ20041005191
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
發(fā)明者宗敏華, 婁文勇, 許若 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)