一種酵母生產(chǎn)(s)-三氟苯乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到解脂假絲酵母細(xì)胞生物催化制備手性 醫(yī)藥中間體（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對(duì)稱反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，作為 綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來(lái)越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過(guò)程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對(duì)稱合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動(dòng)力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來(lái)，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長(zhǎng)。目前，采用水解酶動(dòng)力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對(duì)于動(dòng)力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢(shì)在于理論收率可達(dá)100%，原子 經(jīng)濟(jì)性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時(shí)免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重要手性砌 塊，?，F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán)重缺陷， 難于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用解脂假絲酵母細(xì)胞催化制備（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇，反應(yīng)式如下：
2, 2, 2-三氟苯乙酮（1)經(jīng)解脂假絲酵母催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（S)- 2, 2, 2-三氟苯乙 醇（2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用解脂假絲酵母作 為催化劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對(duì)映體過(guò)量率（ee%)均很高。
[0007] 許多解脂假絲酵母都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng) 實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明選用解脂假絲酵母菌株為ATCC20688，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)時(shí)，為促進(jìn)輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定的輔助底物為：葡萄糖26-30g/L、木糖20-24g/L、異 丙醇7-9%V/V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉； 2、 培養(yǎng)液成份：：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黃豆粉 16-20g/L，KH2PO4 4.4-5.5g/L，MgSO4 7H20 0.5-0. 6g/L，pH6. 7。
[0011] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0012] 解脂假絲酵母細(xì)胞制備。解脂假絲酵母經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā) 酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將解脂假絲酵母種子液接種至 發(fā)酵罐，接種比例為8-8. 5%，通氣比為0. 5-0. 6VAV分鐘），24-25°C培養(yǎng)48-54小時(shí)，用過(guò) 濾式離心機(jī)離心得到濕解脂假絲酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0013] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 3,加入底 物2, 2, 2-三氟苯乙酮，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：?jiǎn)斡仓岣视王ズ繛?15- 16g/L，葡萄糖26-30g/L、木糖2〇-24g/L、異丙醇7-9%V/V(體積濃度），121 °C高壓滅 菌30分鐘；冷卻至27-28°C時(shí)，加入濕解脂假絲酵母細(xì)胞使其濃度為82-85g/L，通氣比為 0. 12-0. 125V/ (V分鐘），進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為80-84小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì) 胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)- 2,2,2_三氟苯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化 率98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對(duì)映體過(guò)量率98. 5-99 %。
[0014] 本發(fā)明所開(kāi)展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0015] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉； 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黃豆粉 16- 20g/L，KH2PO4 4.4-5.5g/L，MgSO4 7H20 0.5-0. 6g/L，pH6. 7。
[0016] 濕解脂假絲酵母細(xì)胞制備過(guò)程如下：解脂假絲酵母ATCC20688經(jīng)斜面、搖瓶培 養(yǎng)，得到種子液。IL發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻 至24-25tC，將解脂假絲酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為8-8. 5 %，通氣 比為0. 5-0. 6V/ (V分鐘），24-25°C培養(yǎng)48-54小時(shí)，用過(guò)濾式離心機(jī)離心得到濕解脂假絲 酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0017] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 3,加入 底物2, 2, 2-三氟苯乙酮，使其濃度為80g/L，單硬脂酸甘油酯含量為15g/L，葡萄糖26g/L、 木糖24g/L、異丙醇9%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至27-28°C時(shí)，加入濕 解脂假絲酵母細(xì)胞使其濃度為82g/L，通氣比為0. 12V/ (V分鐘)，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng) 時(shí)間為84小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物 (S)- 2, 2, 2-三氟苯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%，產(chǎn)品收率97%，對(duì)映體過(guò)量率98. 5%。
[0018] 實(shí)施例2 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，MgSO