一種細胞法生產(s)-氟基苯乙醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到解脂假絲酵母細胞生物催化制備手 性醫(yī)藥中間體（S)-1-(4-氟基苯）乙醇的技術。
【背景技術】
[0002] 手性（S)-l_(4-氟基苯）乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點，作為 綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性（S)-l_(4-氟基苯）乙醇具有很好的應用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%，原子 經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現體內輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-l_(4-氟基苯）乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌 塊，?，F有的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷， 難于進行工業(yè)化生產。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備（S)-l_(4-氟基苯）乙醇。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明采用解脂假絲酵母細胞催化制備（S)-1-(4-氟基苯）乙醇，反應式如下：
對氟苯乙酮（1)經解脂假絲酵母催化反應，得到產物（S)-l_(4-氟基苯）乙醇（2)。有 多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用解脂假絲酵母作為催化劑， 因為其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多解脂假絲酵母都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經 實驗，本發(fā)明選用解脂假絲酵母菌株為ATCC20460，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經過大量實驗確定的輔助底物為：葡萄糖20-23g/L、異丙醇7-9%V/ V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質： 1、 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉； 2、 培養(yǎng)液成份：：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黃豆粉 16-20g/L,KH2PO4 4.4-5.5g/L,MgSO4 7H20 0.5-0.6g/L,pH7. 0〇
[0011] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0012] 解脂假絲酵母細胞制備。解脂假絲酵母經斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā) 酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將解脂假絲酵母種子液接種至 發(fā)酵罐，接種比例為6-7 %，通氣比為0. 5-0. 6VAV分鐘），24-25°C培養(yǎng)48-54小時，用過濾 式離心機離心得到濕解脂假絲酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0013] 生物催化轉化。底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 5,加入底物 對氟苯乙酮，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：單硬脂酸甘油酯含量為10-12g/L，葡萄 糖20-23g/L、異丙醇7-9%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至23-24°C時，加 入濕解脂假絲酵母細胞使其濃度為90-95g/L，通氣比為0. 08-0. 085V/ (V分鐘)，進行生物 催化反應，反應時間為86-90小時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙 酸乙酯，得到產物（S)-1-(4-氟基苯）乙醇，反應轉化率98-99%，產品收率96-97%，對映 體過量率98. 5-99%。
[0014] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優(yōu)化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0015] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉； 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黃豆粉 16-20g/L，KH2PO4 4.4-5.5g/L，MgSO4 7H20 0.5-0. 6g/L，pH7.0。
[0016] 濕解脂假絲酵母細胞制備過程如下：解脂假絲酵母ATCC20460經斜面、搖瓶培 養(yǎng)，得到種子液。IL發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻 至24-25tC，將解脂假絲酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為6-7 %，通氣比 為0. 5-0. 6V/(V分鐘)，24-25°C培養(yǎng)48-54小時，用過濾式離心機離心得到濕解脂假絲酵 母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0017]生物催化轉化：0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 5,加入 底物對氟苯乙酮，使其濃度為80g/L，單硬脂酸甘油酯含量為12g/L，葡萄糖23g/L、異丙醇 7%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至24°C時，加入濕解脂假絲酵母細胞使其 濃度為90g/L，通氣比為0. 085VAV分鐘），進行生物催化反應，反應時間為86小時；反應結 束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（S)-l-(4-氟基苯）乙 醇，反應轉化率99 %，產品收率97 %，對映體過量率98. 5 %。
[0018] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10,KH2PO4 2g/L，