一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的檢測(cè)技術(shù)，特別是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒和 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Y.entrocolitica)是一種革蘭氏陰性桿菌或球菌，隸屬 于腸桿菌科耶爾森菌屬，是繼鼠疫耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森氏菌之后的又一致病菌。該 菌早在20世紀(jì)80年代便受到國(guó)際社會(huì)關(guān)注，已從環(huán)境、水體、人群、動(dòng)物和食物中檢出該 致病菌，并可通過人-人、人-動(dòng)物、動(dòng)物-動(dòng)物、食品、水源等途徑進(jìn)行傳播。由該菌引起 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為急性腹痛、腹瀉、嘔吐等胃腸現(xiàn)象及結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、肝 炎、敗血癥等并發(fā)癥?；谝陨咸匦裕∧c結(jié)腸炎耶爾森氏菌已成為我國(guó)進(jìn)出口食物必檢微 生物之一。
[0003] 傳統(tǒng)檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法需通過中溫增菌培養(yǎng)、理化鑒定、血清學(xué) 分析等一系列復(fù)雜過程，存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作繁瑣等特點(diǎn)，而且檢出率不高，不利于及時(shí)準(zhǔn) 確診斷小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，因此有必要建立一種簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)技術(shù)。目前報(bào) 道的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)方法主要有熒光定量及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，這些方法不僅 需要昂貴的儀器設(shè)備，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能要求也較高，不利于普及運(yùn)用。隨著分子 生物學(xué)的迅速發(fā)展，相關(guān)學(xué)者對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的毒力基因及致病機(jī)制有了更加深 入細(xì)致的了解，這為從分子水平上鑒定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及評(píng)估菌株的毒力提供了理 論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。
[0004] 公告號(hào)為103468811B的專利公開了一種檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的試劑盒， 其需要用6對(duì)引物對(duì)同時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增復(fù)雜，成本高，靈敏度僅10 5CFU/mL。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒和檢 測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明首先提供了 SEQ ID NO :1 ~2、SEQ ID NO :3 ~4 以及 SEQ ID NO :5 ~6 所示引物對(duì)。
[0007] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1 ~2、SEQ ID NO :3 ~4 以及 SEQ ID NO :5 ~6 所 示引物對(duì)在制備檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的試劑中的用途。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒，它包括SEQ ID NO: 1~2、SEQ ID NO :3~4以及SEQ ID NO :5~6所示引物對(duì)。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0010] a，提取樣本DNA:提取待檢樣本中的DNA;
[0011] b，基因擴(kuò)增：用前述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0012]c，結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
[0013] 其中，步驟a所述的樣本為養(yǎng)殖水體。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以特異擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，特異性強(qiáng)，靈 敏度達(dá)17. 04X10 3ng/yL，耗時(shí)短，用于快速檢測(cè)水源、食品，可及時(shí)有效地預(yù)防小腸結(jié)腸 炎耶爾森氏菌感染性疾病的發(fā)生，具有良好的應(yīng)用前景。
[0015] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0016] 圖1小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail、inv、intB的3重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖以及單 重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中M:DL2000Marker;1 :ail、inv、intB的 3 重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2:ail基 因的擴(kuò)增產(chǎn)物，351bp;3 :inv基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，520bp;4 :intB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，722bp;
[0017] 圖2是檢測(cè)擴(kuò)增體系特異性的電泳圖，其中M:DL2000Marker;A1，A2 :均為鯽魚小 腸耶爾森氏菌；2 :丁鮭魚維氏氣單胞菌；3 :炮彈魚哈維氏弧菌；4 :虎皮鯰魚假單胞菌；5 : 壽星魚最小弧菌；6 :河豚魚嗜水氣單胞菌：7 :非洲慈鯛魚檸檬酸桿菌；8 :胭脂魚中間氣單 胞菌。
[0018] 圖3是檢測(cè)擴(kuò)增體系靈敏度的電泳圖，其中M:DL2000Marker; 1 :小腸結(jié)腸炎 耶爾森氏菌n.CMng/yLJA.SSng/yLddjlng/yLddT.CMXlOing/yLj: 17. 04X10 2ng/yL；6 ：17. 04X10 3ng/yL；7 ：17. 04X10 4ng/ ^L；8 ：17. 04X10 5ng/yL； 9 :17. 04X10 6ng/yL。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0020] 1、試驗(yàn)菌株
[0021] 表1試驗(yàn)菌種表

[0023] 2、主要試劑和器材
[0024] CIN-I培養(yǎng)基及配套試劑、改良Y培養(yǎng)基-杭州微生物試劑有限公司；Premix Taq(TaKaRaTaqVer. 2.Oplusdye)、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品（DL2000Marker) 100 ~2000bp_ 大 連寶生生物有限公司；GoldenView-;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒-天根生物有限公司； Tris-Amresco;乙二胺四乙酸、冰乙酸-成都科龍化工試劑廠；瓊脂-GENECOMPANYLTD;PCR 儀-Eppendorf，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)-BioRAD。
[0025] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
[0026] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0027] 1、PCR引物設(shè)計(jì)與合成
[0028] 針對(duì) ail 基因的上下游引物（SEQIDNO. 1 ~2) :ail_F :5 '-taa tgt gta cgc tgc gag-3 '，ail-R :5 ' -gac gtc tta ctt gca ctg-3 '，預(yù)期片段大小 351bp ;inv 基 因上下游引物（SEQIDNO. 3 ~4) :intB_Forword :5 ' -tgc gcc atg egg tcc atc_3 '， intB-Reverse :5 ' -ggt gca taa gat tct cgg-3 '預(yù)期片段大小520bp ;intB基因上下游 引物（SEQIDNO. 5 ~6) :intB_F :5 ' -tgc gcc atg egg tcc atc_3 '，intB-R :5 ' -ggt gca taa gat tct cgg_3z，預(yù)期片段大小722bp。引物均有上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合 成。
[0029] 2、模板制備
[0030] 將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌置于37°C條件下快速復(fù)蘇后分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基 中28°C培養(yǎng)18h，按天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA，作為模 版用于PCR擴(kuò)增。
[0031] 3、PCR 擴(kuò)增
[0032] 單重PCR擴(kuò)增：
[0033] 反應(yīng)總體系為25yL，PremixTaq12.5yL，上下游引物各IyL，DNA模板LOyL， 雙蒸水8. 5yL。
[0034] 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性45s、50°C退火45s、轉(zhuǎn)72°C延伸40s，30個(gè) 循環(huán)，最后72°C溫育5min，4°C保存待檢。
[0035] 本發(fā)明多重PCR擴(kuò)增：
[0036] 針對(duì)ail:inv:intB的檢測(cè)引物比例為3:2:1.
[0037] 反應(yīng)總體系為25yL，在200yL離心管中一次加入PremixTaq12. 5yL，ail上下 游因?yàn)楦鱅. 5yL，inv上下游引物各1. 0yL，intB上下游引物各0. 5yL，DNA模板2. 0yL， 雙蒸水4. 5yL。
[0038] 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性45s、50°C退火45s、轉(zhuǎn)72°C延伸40s，30個(gè) 循環(huán)，最后72°C溫育5min，4°C保存待檢。
[0039] 4、結(jié)果檢測(cè)
[0040] 取5yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和核酸分子量用1%瓊脂糖進(jìn)行水平電泳，置于凝膠成像系 統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0041] 二、結(jié)果
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，針對(duì)ail:inv:intB的單重PCR均能分別擴(kuò)增出目標(biāo)條帶， 本發(fā)明多重PCR能同時(shí)擴(kuò)增三條目標(biāo)條帶。
[0043] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明引物對(duì)可以準(zhǔn)確擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail:inv:intB 基因的基因片段。
[0044] 實(shí)施例2特異性試驗(yàn)
[0045] 一、試驗(yàn)方法
[0046] UPCR引物
[0047] 同實(shí)施例 1 的引物對(duì)（SEQIDNO. 1 ~2、SEQIDNO. 3 ~4、SEQIDNO. 5 ~6 所 示引物對(duì)）。
[0048] 2、模板制備：
[0049] 將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌以及維氏氣單胞菌、哈維氏弧菌、假單胞菌、最小弧菌、 嗜睡氣單胞菌、檸檬酸桿菌、中間氣單胞菌置于37°C條件下快速復(fù)蘇后分別接種于LB肉湯 培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)18h，按天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA， 作為模版用于PCR擴(kuò)增。
[0050] 同實(shí)施例1。
[0051] 3、PCR擴(kuò)增
[0052] 同實(shí)施例1多重PCR擴(kuò)增。
[0053] 4、結(jié)果檢測(cè)
[0054] 同實(shí)施例1。
[0055] 二、結(jié)果
[0056] 結(jié)果如圖2所示，只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可以擴(kuò)增三個(gè)條帶，而其他細(xì)菌則 均無擴(kuò)增條帶。
[0057] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確區(qū)分小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與其他細(xì)菌，特 異性強(qiáng)。
[0058] 實(shí)施例3靈敏度試驗(yàn)
[0059] -、試驗(yàn)方法
[0060] UPCR引物
[0061] 同實(shí)施例 1 的引物對(duì)（SEQID NO. 1 ~2、SEQID NO. 3 ~4、SEQID NO. 5 ~6 所 示引物對(duì)）。
[0062] 2、模板制備：
[0063] 將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌用置于37°C條件下快速復(fù)蘇后分別接種于LB肉湯培養(yǎng) 基中28°C培養(yǎng)18h，按天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA。
[0064] 測(cè)定DNA樣品的濃度，做10倍、20倍、50倍、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7進(jìn)行稀 釋。經(jīng)測(cè)定，DNA樣品的濃度為170. 4ng/yL，稀釋后得到濃度為17. 04ng/yL、8. 52ng/yL、 3. 41ng/yL、17. 04X10Sg/yL、17. 04X10 2ng/yL、17. 04X10 3ng/yL、17. 04X10 4ng/ yL、17. 04X10 5ng/yL、17. 04X10 6ng/yL的DNA樣品液。
[0065] 3、PCR擴(kuò)增
[0066] 同實(shí)施例1多重PCR擴(kuò)增。
[0067] 4、結(jié)果檢測(cè)
[0068] 同實(shí)施例1。
[0069] 二、結(jié)果
[0070] 如圖3所示，樣品液DNA濃度為17. 04ng/yL時(shí)能出現(xiàn)清晰條帶，樣品液DNA濃度 小于17. 04X10 3ng/yL時(shí)出現(xiàn)模糊不清的條帶，因此可確測(cè)定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的 最低模板濃度為17. 04X10 3ng/yL。
[0071] 實(shí)驗(yàn)說明，待檢樣品中，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的DNA濃度不低于17. 04X10 3ng/ yL，本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)，靈敏度高。
[0072] 綜上，本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法可以特異擴(kuò)增小腸結(jié)腸炎耶爾森氏 菌，特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，檢測(cè)快速，具有良好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. SEQ ID NO :1 ~2、SEQ ID NO :3 ~4 以及 SEQ ID NO :5 ~6 所示引物對(duì)。 2. SEQ ID NO :1~2、SEQ ID NO :3~4以及SEQ ID NO :5~6所示引物對(duì)在制備檢測(cè) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的試劑中的用途。3. -種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO :1~2、 SEQ ID NO :3~4以及SEQ ID NO :5~6所示引物對(duì)。4. 一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟： a，提取樣本DNA :提取待檢樣本中的DNA ; b，基因擴(kuò)增：用權(quán)利要求3所述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； c，結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟a所述的樣本為水源、食品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒，它包括SEQ？ID？NO：1～2、SEQ？ID？NO：3～4以及SEQ？ID？NO：5～6所示引物對(duì)。本發(fā)明還公開了一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)方法以及三對(duì)引物對(duì)及其用途。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，檢測(cè)快速，可以用于水源、食品的快速檢測(cè)和預(yù)測(cè)，預(yù)防疾病的發(fā)生，提高經(jīng)濟(jì)效益。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105087576
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510634138
【發(fā)明人】王利, 茍小蘭, 段薈芹
【申請(qǐng)人】西南民族大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月29日