充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞共培養(yǎng)，能夠顯著提高分化百分率且所需培養(yǎng)周期較短。采用 的臍帶間充質(zhì)干細胞來自臍帶和胎盤，來源廣泛，不受倫理和法理限制。
【附圖說明】
[0044] 圖1示經(jīng)傳遞3~5代的hUC-MSCs細胞形態(tài)（100X);
[0045] 圖2-a示原代培養(yǎng)12h的羊膜上皮細胞形態(tài)（40X);
[0046] 圖2-b示傳代培養(yǎng)12h的羊膜上皮細胞形態(tài)（40X);
[0047] 圖2-c示傳代培養(yǎng)24h的羊膜上皮細胞HE染色結(jié)果（100X);
[0048]圖2-d示傳代培養(yǎng)24h羊膜上皮細胞以CK7為抗體免疫組化鑒定（100X);
[0049] 圖2-e示傳代培養(yǎng)24h羊膜上皮細胞以CK8為抗體免疫組化鑒定（100X);
[0050] 圖2-f示傳代培養(yǎng)24h羊膜上皮細胞以CK18為抗體免疫組化鑒定（100X)。
【具體實施方式】
[0051] 本發(fā)明提供了誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜上皮細胞分化的培養(yǎng)基和方法，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方 法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和 范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0052] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0053] 本發(fā)明實施例中用于角膜上皮細胞鑒定的抗體為AEl和AE5,它們都是細胞角蛋 白抗體。AEl可以識別相對分子質(zhì)量分別為56500、50000、48000和40000的酸性細胞角蛋 白，能與角膜上皮細胞的一種相對分子質(zhì)量為48000的酸性角蛋白發(fā)生反應(yīng)，與波形蛋 白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和神經(jīng)絲蛋白等絲狀蛋白無交叉反應(yīng)。AE5能夠與角膜上皮 細胞的角蛋白K3(相對分子質(zhì)量為64000)特異性結(jié)合，與人、兔、牛的角膜上皮細胞有反 應(yīng)，而與皮膚上皮細胞無交叉反應(yīng)。細胞角蛋白K3是分化狀態(tài)較高的角膜上皮細胞的標(biāo) 志蛋白。因此，如果細胞AEl和AE5的免疫組化染色陽性時，那么這種細胞為角膜上皮細 胞。
[0054] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0055] 實施例1臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)
[0056] 將臍帶（乙肝、丙肝、HIV、支原體、梅毒等血清學(xué)檢查均為陰性）置于含有l(wèi)OOU/mL 青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS中漂洗2次，加入預(yù)冷的75%酒精，浸泡l-2min，期間不停 翻動臍帶；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用組織剪將臍帶剪成2_左右的小段，每段用眼科 剪縱向開，用血管鉗去除臍帶內(nèi)三根血管（兩條動脈，一條靜脈），同時去除臍帶外膜；將分 離好的臍帶用眼科剪剪成約1_3大小的組織塊，取適量放入直徑為IOcm的無菌培養(yǎng)皿中， 覆蓋70%培養(yǎng)皿的底面積。加入LONZA人干細胞無血清培養(yǎng)液（LonzaUltra⑶LTURE?)， 5%C02、37°C、濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第5天~7天半量換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 天~14天左右全量換液去掉組織塊同時收集細胞傳代培養(yǎng)。
[0057] 經(jīng)傳遞3~5代的hUC-MSCs細胞形態(tài)如圖1所示，hUC-MSCs生長旺盛，邊界光滑， 呈現(xiàn)巢狀生長，集落大多呈多角形或橢圓形，集落內(nèi)細胞排列緊密，邊界不清；細胞邊界清， 胞漿較豐富，細胞核大，核仁大。
[0058] 取第3代對數(shù)生長期細胞，細胞分離液消化，流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD105、 CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表達情況，Cell-Quest軟件分析結(jié)果。每個樣 本分析6000~8000個細胞。結(jié)果如表1所示：
[0059] 表1第3代hUC-MSCs細胞表面標(biāo)志物表達陽性率
[0060]
[0061] 經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，如表1所示，第3代hUC-MSCs高表達⑶105、⑶44和⑶29,低 表達或不表達HLA-DR、⑶31、⑶45、⑶40和⑶34等標(biāo)記物。
[0062] 實施例2羊膜上皮細胞制備
[0063] 人羊膜取自健康產(chǎn)婦（乙肝、丙肝、HIV、支原體、梅毒等血清學(xué)檢查均為陰性）， 將羊膜置于含有l(wèi)OOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素的PBS中漂洗2次，將其剪成約 30-50cm2大小的組織塊，加入足夠量0. 25%胰蛋白酶消化液，在37°C、200R恒溫振蕩器 中消化15~30min,每IOmin取出用手劇烈搖晃，2000rpm離心5min,再加入足夠2. 5g/L 膠原酶II+0.05g/LDnas酶，在37°C下消化4h，離心，再加入含角朊細胞無血清培養(yǎng)基 (Keratinocyteserum-freemedium,KFSM), 10_15ng/ml表皮生長因子（EGF)的培養(yǎng)液，吹 打均勻，以IXIO7個/L接種于直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，置體積分?jǐn)?shù)為5 %C02、37°C細胞 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h后輕輕將未貼壁的細胞吸出，因羊膜上皮細胞貼壁較慢，混雜的間充質(zhì) 細胞或成纖維細胞貼壁較快，這時吸出重新培養(yǎng)的細胞（即差異黏附法獲得的細胞）90% 以上是羊膜上皮細胞。繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合達到80%~90%后，傳代。原代培養(yǎng)12h的細 胞鏡下觀察如圖2-a所示（40倍）。傳代培養(yǎng)12h的細胞鏡下觀察如圖2-b所示（40倍）。 將第2代羊膜上皮細胞培養(yǎng)24h后取出（經(jīng)HE染色鏡下觀察如圖2-c，放大100倍），免疫 組化鑒定細胞角蛋白CK7 (圖2-d)、CK8 (圖2-e)和CK18 (圖2-f)。
[0064] 結(jié)果表明，鏡下觀察第2代羊膜上皮細胞呈圓形、透亮、折光性較強、富有立體感。 經(jīng)差異黏附法培養(yǎng)的原代細胞90%以上為人羊膜上皮細胞，混雜的間充質(zhì)細胞或成纖維細 胞較少，在接種12h內(nèi)可下沉貼壁生長，2d后細胞進入指數(shù)生長期，細胞數(shù)量明顯增多， 呈不規(guī)則的多角形，4~5d左右90%細胞融合成片，形成單層（見圖2-a)。傳代的人羊 膜上皮細胞能較快貼壁，接種4~6h后即可貼壁并開始生長，接種24h后細胞生長加速， 細胞扁平變大，細胞核清晰，位于胞質(zhì)中央。3~d左右細胞90%融合，呈典型的鋪路石 樣外觀（見圖2-c)。蘇木素伊紅染色，可見細胞大小較均一，呈不規(guī)則的多角形，胞質(zhì)豐 富，胞核藍染，圓形，核膜清晰，核仁明顯，可見2~3個核分裂（圖2-c)。免疫組化鑒 定，本實施例培養(yǎng)的人羊膜上皮細胞的胞漿中見CK7、CK8、CK18單克隆角蛋白抗體染色陽 性，胞漿呈棕黃色，胞核呈藍紫色。表明成功分離培養(yǎng)了羊膜上皮細胞。
[0065] 實施例3:
[0066] 取增殖對數(shù)期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮細胞，接種于放有多聚賴 氨酸處理的無菌蓋玻片的Transwell共培養(yǎng)體系中，上室植入羊膜上皮細胞接種密度為 4-6XIO5/孔，下室植入hUC-MSCs，接種密度為1-1. 5XIO5/孔。每孔加入2. 5ml含100U/ mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為55%LONZA人干細胞無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra CULTURE?) ,45%角|j元細胞無血清培養(yǎng)基（Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培養(yǎng) 液，5ng/ml表皮生長因子（EGF)，5ug/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。每隔2-3天更換新的培養(yǎng) 液。培養(yǎng)7天后取出細胞爬片，按照免疫組化染色SP法試劑盒的說明書進行細胞角蛋白 AEl和AE5的免疫組化染色，DAB顯色。免疫組化染色結(jié)果表明，可見少許AEl抗體DAB著 色細胞。呈散在分布，而且細胞著色較淡。AE5抗體淡著色。
[0067] 實施例4:
[0068] 取增殖對數(shù)期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮細胞，接種于放有多聚賴 氨酸處理的無菌蓋玻片的Transwell共培養(yǎng)體系中，上室植入羊膜上皮細胞接種密度為 4-6XIO5/孔，下室植入hUC-MSCs，接種密度為1-1. 5XIO5/孔。每孔加入2. 5ml含100U/ mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為55%LONZA人干細胞無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra CULTURE?) ,45%角|j元細胞無血清培養(yǎng)基（Keratinocyteserum-freemedium,KFSM)的培養(yǎng) 液，lOng/ml表皮生長因子（EGF)，lOug/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。每隔2-3天更換新的培養(yǎng) 液。培養(yǎng)7天后取出細胞爬片，按照免疫組化染色SP法試劑盒的說明書進行細胞角蛋白 AEl和AE5的免疫組化染色，DAB顯色。免疫組化染色結(jié)果表明，可見大量AEl抗體DAB著 色細胞。呈散在分布，而且細胞著色最深。AE5抗體淡著色。
[0069] 實施例5 :
[0070] 取增殖對數(shù)期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮細胞，接種于放有多聚賴 氨酸處理的無菌蓋玻片的Transwell共培養(yǎng)體系中，上室植入羊膜上皮細胞接種密度為 4-6XIO5/孔，下室植入hUC-MSCs，接種密度為1-1. 5XIO5/孔。每孔加入2. 5ml含IOOU/ mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為55%