一種外泌體miRNA的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小分子RNA高通量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外泌體miRNA的定量 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 外泌體（Exosome)是一種晚期核內(nèi)體（也稱為多囊泡體）與胞膜融合后分泌到細(xì) 胞外的膜性小囊泡，電鏡下其外觀是一種特征性的"碟形"小體，直徑在40-100nm之間，由 活細(xì)胞分泌而來，幾乎所有類型的細(xì)胞都能分泌，其攜帶的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分具有其 來源細(xì)胞的特異性，參與調(diào)控許多重要的細(xì)胞生理活動，如免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥 反應(yīng)、凝結(jié)等過程，因此其在相關(guān)疾病包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及癌癥等中具有 重要的研究意義，可成為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，此外Exosome具有細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的功 能，也可作為生物載體用于基因治療。
[0003] 目前腫瘤源性的exosomes內(nèi)的microRNA在癌癥早期診斷中是一個有較大潛力的 研究領(lǐng)域。一些類型的腫瘤異常表達(dá)某些microRNA(miRNA)，這些miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā) 展的關(guān)系已有一些文獻(xiàn)報道；此外基于微創(chuàng)（抽血）或無創(chuàng)（使用尿液或唾液等）的診斷方 法可以減少患者的痛苦和不便，也降低了分析成本，有利于臨床腫瘤早篩檢測的實踐推廣。
[0004] 目前針對exosomes內(nèi)的miRNA在腫瘤早期診斷中的研究僅有為數(shù)較少的報道，而 且絕大多數(shù)研究是基于exosomes的miRNA的總濃度、定量PCR (Q-PCR)以及microRNA芯片 技術(shù)，其更多關(guān)注miRNA的表達(dá)和定量，僅局限于檢測已知的miRNA表達(dá)譜。此外miRNA高 通量測序也正進(jìn)行著相關(guān)嘗試中，盡管其高通量以及探索新的microRNA標(biāo)志物在腫瘤早 期診斷發(fā)展中起到了巨大的推動作用，但是傳統(tǒng)的文庫構(gòu)建存在系統(tǒng)性的偏好性以及較高 的錯誤率，從而影響了檢測的靈敏度，準(zhǔn)確性以及相關(guān)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種外泌體miRNA的定量檢測方法以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明提供的一種外泌體miRNA的定量檢測方法，包括以下步驟：
[0007] ⑴外泌體總RNA的提?。?br>[0008] (2) 3'端和5'端特異性唯一標(biāo)簽接頭連接；
[0009](3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010] (4)miRNA文庫的篩選純化與上機(jī)測序；
[0011] (5)糾錯算法的信息分析。
[0012] 本發(fā)明的外泌體來自人外周血或體液，進(jìn)行外泌體分離后，采用RNA提取試劑盒 進(jìn)行外泌體總RNA的提取。
[0013] 本發(fā)明的外泌體miRNA的定量檢測方法中，步驟（2)所述的特異性唯一標(biāo)簽接頭 連接是指在常規(guī)miRNA接頭的基礎(chǔ)上添加了 8個隨機(jī)的堿基N以及3個固定堿基CGA。接 頭合成時隨機(jī)堿基，由AUCG隨機(jī)合成，因此可以提供4s種標(biāo)簽，即理論上每個原始miRNA片 段將被一組唯一的標(biāo)簽唯一標(biāo)簽識別，從而后續(xù)經(jīng)過一系列PCR擴(kuò)增后，不僅可以基于同 一個DNA模板的所有測序序列（duplication，DUP)簇矯正測序錯誤實現(xiàn)變異的精確檢測， 同時基于每個標(biāo)記的片段，將不再受PCR擴(kuò)增的偏好性影響，實現(xiàn)精準(zhǔn)定量。
[0014] 本發(fā)明方法的步驟（2)在RNA的3'端連接特異性唯一標(biāo)簽接頭的序列為：CGANN NNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC;在5 '端連接特異性唯一標(biāo)簽接頭的序列為： UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。
[0015] 進(jìn)一步地，在步驟（2)特異性唯一標(biāo)簽接頭連接完成后，可以利用RNA濃縮液去除 溶液中的連接緩沖液、多余的鹽離子及其他雜質(zhì)，得到與5'端和3'端連接唯一標(biāo)簽接頭的 RNA〇
[0016] 本發(fā)明方法中，步驟（3)是將5'端和3'端連接唯一標(biāo)簽接頭的RNA反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，加入測序引物進(jìn)行PCR;反轉(zhuǎn)錄引物序列為 GTGACTGGAGTTCAGACGTGT 〇
[0017] 進(jìn)一步地，PCR所用的測序引物序列為：
[0018] 上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC
[0019] TACACGACGCTCTTCCGATCT；
[0020] 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACT
[0021] GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
[0022] 其中 xxxxxxxx 為 index 標(biāo)簽。
[0023] 本發(fā)明的外泌體miRNA定量檢測方法中，步驟（4)miRNA文庫的篩選的方法是將步 驟（3)中的PCR產(chǎn)物中片段大小為150-170bp的cDNA片段回收，即得到主要成分為miRNA 的文庫。
[0024] 在本發(fā)明的實施例中，是選用Illumina HiSeq2500/2000上機(jī)測序，PE101+8+101。
[0025] 本發(fā)明上述方法中，步驟（5)糾錯算法的信息分析包括以下步驟：
[0026] 1)基于固定喊基CGA確定唯一標(biāo)簽位置，將成對測序序列的測序序列一和測序序 列二的唯一標(biāo)簽堿基序列首尾相連，形成16bp的一條索引，并且以這16bp作為成對測序序 列的索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將同一個DNA模板的所有測序序列聚集到一起的目的；
[0027] 2)對聚集起來的擁有相同索引的測序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢 明距離，將每個有相同索引的大簇聚集成若干個小簇，每個小簇中任意兩對成對測序序列 的漢明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；
[0028] 3)對于每個DNA模板的dup簇中的測序序列的每一個測序堿基進(jìn)行互相比對，若 某種堿基型在測序序列中的一致率達(dá)到80%，則記新測序序列的這個堿基為此堿基型，否 則記為N，得到代表原始DNA模板序列的新測序序列；
[0029] 4)基于新測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及比對質(zhì)量小于30的測序序 列；
[0030] 5)根據(jù)4)中得到的測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對確定已知RNA以及進(jìn)行未知RNA的 軟件預(yù)測，同時也進(jìn)行相應(yīng)的注釋與統(tǒng)計定量；
[0031] 6)根據(jù)5)的結(jié)果進(jìn)行表達(dá)譜差異、革巴基因預(yù)測、Passway以及Biomarker其他相 關(guān)分析。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種miRNA定量檢測系統(tǒng)，包括以下操作單元：
[0033] (1)總RNA的提取單元；
[0034] (2) 3'端和5'端特異性唯一標(biāo)簽接頭連接單元；
[0035] (3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增單元；
[0036] (4)miRNA文庫的篩選純化與上機(jī)測序單元；
[0037] (5)糾錯算法的信息分析單元。
[0038] 操作單元（1)中的總RNA為外泌體總RNA。
[0039] 所述單元⑵在RNA的3'端連接特異性唯一標(biāo)簽接頭的序列為：CGANNNNNNNNAG AUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC;在5'端連接特異性唯一標(biāo)簽接頭的序列為：UACACUC UUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA 〇
[0040] 單元（3)中是將5'端和3'端連接唯一標(biāo)簽接頭的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以 cDNA為模板，加入測序引物進(jìn)行PCR;反轉(zhuǎn)錄引物序列為GTGACTGGAGTTCAGACGTGT ;PCR所 用的測序引物序列為：
[0041]上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ;
[0042] 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC CGATCT；
[0043]其中xxxxxxxx為index標(biāo)簽。
[0044] 單元（4)miRNA文庫的篩選的方法是將單元（3)中的PCR產(chǎn)物中片段大小為160bp 的cDNA片段回收，即得到主要成分為miRNA的文庫。
[0045] 本發(fā)明的miRNA定量檢測系統(tǒng)中，操作單元（5)糾錯算法的信息分析包括以下步 驟：
[0046] 1)基于固定喊基CGA確定唯一標(biāo)簽位置，將成對測序序列的測序序列一和測序序 列二的唯一標(biāo)簽堿基序列首尾相連，形成16bp的一條索引，并且以這16bp作為成對測序序 列的索引進(jìn)行外部排序，以達(dá)到將同一個DNA模板的所有測序序列聚集到一起的目的；
[0047] 2)對聚集起來的擁有相同索引的測序序列進(jìn)行中心聚類，根據(jù)插入序列之間的漢 明距離，將每個有相同索引的大簇聚集成若干個小簇，每個小簇中任意兩對成對測序序列 的漢明距離不超過3,以達(dá)到區(qū)分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；
[0048] 3)對于每個DNA模板的dup簇（即同一個DNA模板的所有測序序列）中的測序 序列的每一個測序堿基進(jìn)行互相比對，若某種堿基型在測序序列中的一致率達(dá)到8