分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的特異性引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的特 異性引物及方法，具體為一種鑒別草珊瑚你?/?. )yVaAai，金粟蘭Chloranthusspicatus,Chloranthusserratus, Chloranthushenryi 的分子定量分析的特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該特異性引物對(duì)草珊瑚與金粟蘭，及己 和寬葉金粟蘭等3種混合品快速定量分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草珊瑚5krcai?<irayVaAai，俗稱腫節(jié)風(fēng)，通常用于治療花斑癬、 紫癜、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、外傷?，F(xiàn)代研究表明有治療癌癥、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和非特異性免 疫增強(qiáng)上等藥理作用。然而，野生植物種質(zhì)資源近年來已經(jīng)減少，由于金粟蘭，寬葉金粟蘭、 及己外形與草珊瑚極其相似，很容易與草珊瑚相混淆。但是他們有不同的屬性和藥用價(jià)值， 這些易混植物也都有相應(yīng)的肝毒性作用，及己在嚴(yán)重肝毒性病例報(bào)告和動(dòng)物的毒性研究中 已經(jīng)證實(shí)有顯著肝毒性，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。
[0003] 雖然草珊瑚新鮮葉片可以通過靜脈、附屬物和葉的非腺毛維管束結(jié)構(gòu)之間的顯微 鑒定差異從其混淆品中鑒別出來，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通過形態(tài)學(xué) 和組織學(xué)技術(shù)是很難識(shí)別的。在過去的幾年中，利用化學(xué)分析技術(shù)如TLC、HPLC、MS等識(shí)別 草珊瑚及其相關(guān)制劑已經(jīng)有所記載。雖然這些方法在某種程度上可以補(bǔ)充形態(tài)學(xué)或組織學(xué) 鑒定的局限性，但化學(xué)指紋圖譜只能檢測(cè)部分化合物，只能提供有限的物種組成信息，不能 給我們提供完全鑒別出草珊瑚的方法，而且很難進(jìn)行定量分析，特別是在和它極為相似的 物種相互混雜時(shí)。因此，建立草珊瑚與金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭等產(chǎn)品混合時(shí)進(jìn)行定量分 析方法，比便對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品對(duì)監(jiān)測(cè)質(zhì)量至關(guān)重要。
[0004] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記如RAPD、ISSR和SSR等分子標(biāo)記，ITS (Internaltranscribedspacer)等DNA條形碼技術(shù)提供了可靠的識(shí)別藥材的方法。然而， 這些基于基因組DNA的分子標(biāo)記技術(shù)容易受到基因組DNA降解的影響，由于核基因組DNA 比葉綠體DNA拷貝數(shù)少，在加工過的藥材中更容易遭破壞而導(dǎo)致無法通過其分子標(biāo)記技術(shù) 進(jìn)行鑒別。葉綠體DNAtrnL-F區(qū)域的包含trnL(UAA)內(nèi)含子和間隔，即trnL(UAA)-trnF (GAA)區(qū)作為DNA條形碼，它可以很容易利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，這一序列已被證明可用于 對(duì)多種植物在種水平的識(shí)別，被廣泛用于植物產(chǎn)品的檢測(cè)。
[0005] 本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于干燥或經(jīng)加工過的藥材，基于葉綠體DNA trnL-F區(qū)域的鑒別技術(shù)比基于核基因組DNA的分子標(biāo)記技術(shù)更為穩(wěn)定有效。本研究對(duì)草 珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的trnL-F區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，分析其序列結(jié)構(gòu)和特征，尋找 單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphismSNP)分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)分別識(shí)別草珊 瑚，金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的特異識(shí)別引物，建立多重PCR技術(shù)，鑒定引物的特異性，在 此基礎(chǔ)上，利用這些特異引物對(duì)，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可快速簡(jiǎn)單定量分析草珊瑚與金 粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的方法。本發(fā)明為草珊瑚與3個(gè)混淆種的分子定量分 析提供了技術(shù)支持，對(duì)相關(guān)中藥飲片進(jìn)行定量分析具有非常重要的意義，檢索未見草珊瑚 與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己等3種混淆品的分子定量的發(fā)明專利申請(qǐng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的是提供一種可準(zhǔn)確，快速，簡(jiǎn)單定量分析草珊瑚與金粟蘭、寬葉 金粟蘭和及己3種混淆品的技術(shù)，為相關(guān)草珊瑚飲片與這3種混淆品的混合品定量分析提 供技術(shù)支持。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的的特異性引物，特異識(shí)別草珊瑚的上游特異 性引物SgF:5' -TGAITCTGATAGAIT-TITGAAGAAITGA- 3' 與下游引物trnL-Fb:5' -GGGACTTGAACCCTCACGATT- 3' ；同時(shí)特異性識(shí)別金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭的特異上游引物 ChF:5'_ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC- 3'與下游引物trnL-Ff:5'_ATTTGAACTGGT GACACGAG- 3'。
[0008] 分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的方法，構(gòu)建熒光定量PCR進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反 應(yīng)體系 如下：總量為20yL，從植物中提取10ng的DNA作為擴(kuò)增模版，10yL2XSYBR GreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0.2yM上游特異引物，0.2yM下游通用引 物，其余為無菌水；反應(yīng)程序如下：在實(shí)時(shí)定量PCR儀器（ABI7900)種，50°C預(yù)變性2分鐘， 95°C預(yù)變性10分鐘，在95°C變性15s，引物退火58°C15s和在72°C延伸30s，40個(gè)循環(huán)。 [0009] 具體方法如下： (1)設(shè)計(jì)特異識(shí)別引物，并驗(yàn)證其特異性 根據(jù)前期測(cè)序?qū)嶒?yàn)所得的草珊瑚、金粟蘭，及己和寬葉金粟蘭的trnL-F基 因序列，分析其特異SNP位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)草珊瑚的上游特異性引物38?(5'_ TGAITCTGATAGAITITTGAAGAAITGA- 3'）、設(shè)計(jì)可同時(shí)特異性識(shí)別金粟蘭，及己和寬葉金粟 蘭的特異上游引物ChF(5'-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC- 3'）與下游通用引物trnL-Ff (5' -AITTGAACTGGTGACACGAG- 3'），構(gòu)建多重PCR體系：總量為 20yL，取 10ng 植物中提取的DNA作為模版，加入1yL1XTransStartTopTaqDNA聚合酶反應(yīng)液，2yL 10XTransStartTopTaqBuffer，dNTP2. 5mM, 0.2yM下游引物trnL-Ff和上游的兩個(gè)特 定的引物SgF、ChF各0. 1yM，其余為無菌水。構(gòu)建多重PCR體系，反應(yīng)程序如下：在95°C 預(yù)變性2分鐘，在95°C變性30s，在50°C下引物退火30s和在72°C下延伸2分鐘，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)在72°C延伸7分鐘，以確保完整的延伸產(chǎn)品。只有草珊瑚取得了 575 bp，金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭生成特定的216bp，混合樣品則同時(shí)產(chǎn)生575bp與216bp等 2條條帶。確認(rèn)引物的特異性。
[0010] (2)定量分析方法： 草珊瑚的上游特異性引物SgF(5'_TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA- 3'）與下游引 物trnL-Fb(5 ' -GGGACTTGAACCCTCACGATT- 3 '）形成特異識(shí)別草珊瑚的引物對(duì)、同時(shí)特異 性識(shí)別金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭的特異上游引物ChF( 5 ' -ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC -3'）與下游引物trnL-Ff(5' -AITTGAACTGGTGACACGAG- 3'）形成特異識(shí)別金 粟蘭、及己和寬葉金粟蘭等3種樣品的引物對(duì)，分別構(gòu)建實(shí)時(shí)定量PCR體系。構(gòu)建熒光定量 PCR進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系如下：總量為20yL，從植物中提取10ng的DNA作為擴(kuò)增 模版，10yL2XSYBRGreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0? 2yM上游特異引 物與0. 2yM下游通用引物，其余為無菌水；反應(yīng)程序如下：在實(shí)時(shí)定量PCR儀器（ABI7900) 中，50°C預(yù)變性2分鐘，95°C預(yù)變性10分鐘；在95°C變性15s，引物退火58°C15s和在 72°C延伸30s，40個(gè)循環(huán)。引物SgF和trnL-Fb用于混合產(chǎn)品中草珊瑚的定量分析；引物 ChF和trnL-Ff用于混合產(chǎn)品中的金粟蘭屬（金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭）的定量分析。所 有引物的濃度均為0. 2yM。實(shí)時(shí)定量PCR方法用于定量分析方法可由相對(duì)定量分析方法 R=2AAet法推導(dǎo)出來，由于同一DNA樣品中以其總DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，混合樣品總模版 DNA相應(yīng)的Ct(total)值是恒定的，即特定一個(gè)混合樣品中的Ct(total)值是不變的。則 摻雜物數(shù)量的比率在同一個(gè)樣本中可以通過這個(gè)公式計(jì)算：
Ct(total))為總混合樣本的Ct值，Ct(Sg)為引物SgF、trnL-Fb的Ct值，即代表草 珊瑚含量的Ct值，Ct(Ch)為引物trnL-Ff、ChF的Ct值，即代表三種混淆品含量的Ct值。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 由于僅根據(jù)某些特征活性成分含量進(jìn)行定量分析，易受植物成長(zhǎng)環(huán)境等外在條件的影 響，很難進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本方法基于遺傳物質(zhì)DNA的含量進(jìn)行分子定量，不受藥材的產(chǎn)地等 外在因素的影響，相對(duì)于化學(xué)定量方法，更為準(zhǔn)確，也更為簡(jiǎn)單方便。
[0012] 由于葉綠體DNA比基因組DNA的拷貝數(shù)更多，在干燥及加工后的產(chǎn)品中更為穩(wěn)定， 本方法利用葉綠體DNA作為定量