外周白介素35多肽及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及用于預防和治療或預防類風濕性關節(jié)炎的多肽。
【背景技術】：
[0002] 類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)是臨床最常見的炎性關節(jié)病和主要致 殘因素之一。在全世界約為0.5%-1.0%，RA的發(fā)病在我國約為0.4%。RA可發(fā)生于任何 年齡，隨著年齡的增長，發(fā)病率也隨之增高。女性高發(fā)年齡為45-55歲，性別與RA發(fā)病關系 密切，男女之比約1: 3。RA是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、 多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病?；颊叱Ｒ允植炕蛲?部疼痛及腫脹（特別是腕背部的腫脹）為首發(fā)癥狀，癥狀持續(xù)不緩解，普通的對癥治療雖可 以緩解癥狀，但常常由于用藥不規(guī)則或不足量而導致癥狀反復。病情進展時可以出現(xiàn)明顯 的晨僵，通常可達1小時以上，并不斷加重；同時出現(xiàn)一定的關節(jié)功能障礙。
[0003] 類風濕關節(jié)炎的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，其基本病理特點是血管炎和滑膜 炎。關節(jié)內(nèi)滑膜血管增生，形成血管翳，導致滑膜增厚，滲出增多，分泌多種細胞因子，侵犯 軟骨并引起骨質(zhì)損害。對其周圍的肌腔、韌帶、腱鞘以及肌肉等組織也均可侵蝕，從而影響 關節(jié)的穩(wěn)定，容易發(fā)生關節(jié)畸形而出現(xiàn)功能障礙。血管炎亦可侵犯周身各臟器組織，形成系 統(tǒng)性疾病。
[0004] 目前治療RA的藥物分為兩大類：控制癥狀藥和控制疾病藥。由于RA病因不明， 故當今并無堪稱控制疾病的藥?？刂瓢Y狀的抗風濕藥分為四類：一、非留體類抗炎藥，通常 稱為一線藥，這類藥物種類繁多，國內(nèi)市場已多達數(shù)十種。二、類固醇激素，激素是一個非常 好的止痛抗炎藥，但長期單獨使用不能改善病情，反而帶來許多副作用，激素作為二線慢作 用藥起效前的過渡性用是可以的，但用量要小，時間不宜過長。在病情較重，伴有關節(jié)外表 現(xiàn)的患者，短期治療沖擊，并聯(lián)合二線藥治療時必須的。三、慢作用抗風濕藥，通常稱為二線 藥，所謂慢作用藥包括抗瘧藥、金鹽、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它們治療RA起效慢，長期作 用對RA病情有一定緩解作用，故也稱病情改善藥。四、免疫多肽：常用有甲氨喋呤、環(huán)磷酰 胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青風藤等。因此，急需開發(fā)更安全、有效的新型抗類風濕關節(jié)炎藥物。
[0005] 白介素-35 (IL-35)是最近發(fā)現(xiàn)的抗炎性細胞因子，能夠調(diào)節(jié)免疫反應，從而阻止 及延緩免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，在人體內(nèi)它大部分是由調(diào)節(jié)性T細胞分泌，并 且是該細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用所必須的關鍵細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-35與關節(jié)炎的密切 相關。細胞因子是免疫調(diào)節(jié)者，在周圍淋巴組織和靶器官中的細胞因子在觸發(fā)自身免疫性 關節(jié)炎的最初階段發(fā)揮著強烈的影響作用。對敏感的個體，它可以推動關節(jié)的炎癥與關節(jié) 的破壞。IL-35具有抑制免疫功能，可以有效地抑制炎癥細胞因子和效應性T細胞分泌，阻 止TH17細胞分化、抑制其功能，影響IL-17水平和功能。Niedbala等用DBA/1小鼠建立膠 原誘導小鼠關節(jié)炎（CIA)模型，發(fā)現(xiàn)注射IL-35后小鼠關節(jié)炎的發(fā)生率和數(shù)量顯著降低，臨 床癥狀改善，組織病理學改變減輕，這一發(fā)現(xiàn)表明，IL-35是類風濕關節(jié)炎的一個潛在治療 目標。盡管如此，并沒有成熟開發(fā)的外周白介素35多肽問世，用于治療RA。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有抗類風濕關節(jié)炎藥物的特點，設計一種小分子的外周白介 素35多肽，適用于臨床的治療類風濕關節(jié)炎的應用。
[0007] 本發(fā)明技術方案是提供一種外周白介素35多肽，其序列為 EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV，及在治療或預防類風濕性關節(jié)炎藥物中的應用。
[0008] 有益結果：
[0009] 本發(fā)明中的外周白介素35多肽序列EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV，可以發(fā)揮白介素 35的作用，與白介素35受體產(chǎn)生的生理或病理的效應，達到預防或治療類風濕性關節(jié)炎的 效果。
[0010] 發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲知外周白介素35多肽能夠抑制佐劑型大鼠類風濕關節(jié)炎 和DBA/1小鼠膠原型類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展，體內(nèi)實驗證明具有顯著的治療類風濕型關節(jié) 炎的效果。說明本發(fā)明設計的外周白介素35多肽科學、合理、可行、有效，能作為治療或預 防類風濕性關節(jié)炎藥物。
【具體實施方式】
[0011] 本發(fā)明多肽由上海吉爾合成。
[0012] 實施例1
[0013] 外周白介素35多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用
[0014] 構建膠原型小鼠關節(jié)炎動物模型，研究外周白介素35多肽對小鼠膠原誘導性關 節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA)的治療作用。采用小鼠作為受試動物，SPF級 DBA/1小鼠60只（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK(滬）2008-0016)，雄性，7-8周齡，體重為 18-22g，隨機分成6組，分別是正常對照組，模型對照組，多肽低中高3個劑量組（0. 4,0. 8， 1.6mg/kg)和陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立小鼠 CIA模型，方法是雞軟骨II型膠原（c II )用0. lmol/1醋酸溶解成4mg/ml的溶液，于4°C冰 箱過夜。實驗當天用 II 型膠原與含 4mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv 的完全弗氏佐劑（CFA)等體積充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內(nèi)每只注射乳化 劑50 μ 1進行致敏，21d后用4mg/ml的II型膠原（c II )與不完全弗氏佐劑（IFA)等體積 充分乳化后以相同劑量的乳化劑于尾部進行再次免疫。造模第30d起皮下注射給藥：多肽 的3個劑量組（0. 4,0. 8,1. 6mg/kg):每日兩次，連續(xù)10天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤2mg/ kg):每五天一次，連續(xù)3次；正常對照組和模型對照組（生理鹽水）：連續(xù)10天。分別于造 模后第40天關節(jié)評分、檢測左右后足足踝直徑來觀察藥物對小鼠膠原型關節(jié)炎的影響。
[0015] 外周白介素35多肽在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用具體結果 如下：外周白介素35多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎關節(jié)腫脹度的影響，陽性對照組、外周白介 素35多肽高、中、低劑量組關節(jié)腫脹度與模型組比較，均有極顯著性差異（P〈0. 01)實驗結 果具有統(tǒng)計學意義。外周白介素35多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎足爪腫脹度的影響，陽性對 照組、外周白介素35多肽高、中、低劑量組足爪腫脹度與模型組比較，均有極顯著性差異 (P〈0. 01)，實驗結果具有統(tǒng)計學意義。多肽對膠原型關節(jié)炎小鼠關節(jié)評分的影響，多肽低、 中、高劑量組四肢評分顯著低于模型對照組（P < 0. 01)，與模型對照組比較極顯著性差異， 實驗結果具有統(tǒng)計學意義。
[0016] 表1外周白介素35多肽對膠原型關節(jié)炎的影響（means土SD)
[0018] · *Ρ〈0· 05 ;林P〈0. 01 (和模型組比較）
[0019] 結論：外周白介素35多肽對小鼠膠原型關節(jié)炎具有治療作用。
[0020] 實施例2
[0021] 外周白介素35多肽對佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用
[0022] 構建佐劑型大鼠關節(jié)炎動物模型，研究多肽對佐劑性關節(jié)炎（Ad juvant arthritis，AA)大鼠的治療作用。采用大鼠作為受試動物，SPF級SD大鼠60只（由上海西 普爾-必凱實驗動物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，動物生產(chǎn)許 可證號碼：SCXK (滬）2008-0016)，雄性，體重為140g-160g，隨機分成6組，分別是正常對照 組，模型對照組，外周白介素35多肽低中高3個劑量組（0. 2,0. 4,0. 8mg/kg)和陽性藥對照 組（甲氨蝶呤lmg/kg)。除正常組外，第0天各實驗組建立大鼠 AA模型，方法是在大鼠的 左側(cè)后足足跎注射含滅活的結核分枝桿菌（H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐劑0. 08ml造成大 鼠佐劑性關節(jié)炎模型。造模第10天起皮下注射給藥：多肽的3個劑量組（0. 2,0. 4,0. 8mg/ kg):每日兩次，連續(xù)10天；陽性藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg):每五天一次，連續(xù)3次；正常 對照組和模型對照組（生理鹽水）：連續(xù)10天。分別于造模后第21天關節(jié)評分、檢測左右 后足足踝直徑來觀察藥物對大鼠佐劑型關節(jié)炎的影響。
[0023] 多肽在佐劑性大鼠關節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用，具體結果如下：外周白介 素35多肽對大鼠原發(fā)性關節(jié)炎左后足踝直徑的影響，大鼠陽性對照組、外周白介素35多肽 的低、中、高劑量組左后足踝直徑與模型組比較，有極顯著性差異（P〈〇. 01);外周白介素35 多肽對大鼠繼發(fā)性關節(jié)炎右后足踝直徑的影響，大鼠陽性對照組、外周白介素35多肽低、 中、高劑量組右后足踝直徑與模型組比較，有顯著性差異（P〈〇. 05)。外周白介素35多肽對 佐劑型關節(jié)炎大鼠關節(jié)評分的影響，多肽低、中、高劑量組四肢關節(jié)評分顯著低于模型對照 組（P < 0. 05)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。
[0024] 表2外周白介素35多肽對佐劑型關節(jié)炎的影響（means土SD)
[0025]
[0026] · *Ρ〈0· 〇5 ;**Ρ〈0· 01 (和模型組比較）
[0027] 結論：外周白介素35多肽對AA大鼠關節(jié)炎具有治療作用。
【主權項】
1. 外周白介素35多肽，其特征在于其序列為EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV。2. 權利要求1的多肽在治療和預防類風濕關節(jié)炎疾病中的應用。3. 根據(jù)權利要求2任一所述多肽的用途，其特征在于：可通過多種給藥方式治療和預 防類風濕關節(jié)炎疾病，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠 囊等，鼻噴劑等。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領域，具體涉及外周白介素35，能預防和治療類風濕性關節(jié)炎的多肽。其序列為EAARTCSRLLTPSIHLISGAHVV？是全新的序列，本發(fā)明的有益效果是可用于治療類風濕性關節(jié)炎，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【IPC分類】A61P19/02, C07K14/54, A61P29/00, A61K38/20
【公開號】CN105061583
【申請?zhí)枴緾N201510556864
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月5日