一種紅球菌株c3、含該菌株的微生物菌劑及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物強化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅球菌及其在廢水處理 中的應用紅球菌株C3,特別涉及到酚類有機污染物的生物處理。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯酚屬高毒物質(zhì)，對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎 功能，高濃度酚可使蛋白質(zhì)凝固及引起組織損傷、壞死。在水體中，5~25mg/L的苯酚即可 對魚類的生存構(gòu)成威脅。由于苯酚具有致癌、致畸、致突變的潛在毒性，各國都相繼提出了 把苯酚列為水中優(yōu)先控制污染物。含有酚類物質(zhì)的主要來自于石油煉化、煤焦化廠、煤氣 廠，若此類廢水未經(jīng)處理而大量排放，就會造成嚴重的環(huán)境污染，嚴重危害人體健康和生態(tài) 環(huán)境。因此，如何有效地處理含酚廢水是環(huán)境污染防治領(lǐng)域迫切解決的問題。
[0003]目前研究和應用的高含酚類物質(zhì)的廢水處理技術(shù)包括蒸餾、液液萃取、吸附、滲透 蒸發(fā)、高級氧化和生物處理等。生物處理法是較為經(jīng)濟、實效、無污染轉(zhuǎn)移、操作簡便易掌握 的典型工藝技術(shù)，也是當今廢水處理的主流方法。但由于高濃度酚類物質(zhì)的存在，導致傳 統(tǒng)活性污泥法等生物處理技術(shù)，具有污泥馴化時間長、處理效果不穩(wěn)定、耐沖擊性能差等問 題。而向污水處理設施中投加高效降解菌，可以在低成本的前提下大大提高降解效率。
[0004] 近年來，研究在自然環(huán)境中具有競爭優(yōu)勢的特種微生物已經(jīng)成為水處理新的熱 點。國內(nèi)外研究者已經(jīng)對一些高效降解菌進行了研究，例如，假單胞菌屬具有代謝多種化合 物的能力，對例如芳香烴類、芳烴衍生物等化合物具有相當高的降解活性；棒桿菌屬是裂解 雜環(huán)化合物和碳氫化合物鏈的主要菌種；節(jié)桿菌屬可氧化烴類化合物、留體化合物等；這 些高效菌種在難降解有機廢水（TNT廢水、造紙廢水、染料廢水和焦化廢水等）處理方面具 有廣闊的應用前景。
[0005] 包埋固定化微生物技術(shù)表現(xiàn)為微生物密度高、具有抗沖擊負荷及適應性廣的特 點。其生長與分布不會因治理底物的存在而發(fā)生改變，而且采用的包埋固定化材料和方法 又有較強的針對性。因此，微生物包埋固定化技術(shù)是使微生物得到更廣泛、更有效應用的一 種重要手段，其在處理廢水領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供一株可高效降解苯酚的菌株，為含酚廢水的治理提供 理論基礎和技術(shù)支持。
[0007] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種利用上述紅球菌生產(chǎn)的微生物菌劑。
[0008] -株紅球菌株C3,其特征在于，所述的菌株由下述步驟制備而得：
[0009] 按1%接種量吸取一定量的焦化廠廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥樣品至苯酚的新 鮮富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；富集瓶混濁后，取一定量的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到增長一定濃度的苯酚 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；依次類推，逐級提高苯酚濃度至l〇〇〇mg/L ;將經(jīng)過苯酚濃度為lOOOmg/ L的富集培養(yǎng)基富集后的菌體轉(zhuǎn)接苯酚濃度為1000mg/L無機鹽培養(yǎng)基中馴化；采用稀釋涂 布和劃線的方法，在分離培養(yǎng)基平板上分離篩選以苯酚為唯一碳源和能源的菌株；
[0010] 所述液體富集培養(yǎng)基組分為蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、去離子水和苯酚，其中蛋 白胨：牛肉膏：氯化鈉：去離子水的質(zhì)量比為10:3:5:1000,苯酚濃度根據(jù)需要添加；所述 的無機鹽液體培養(yǎng)基以苯酚為唯一碳源，組分及質(zhì)量比為0. 5KH2P04:0. 5K2HP04:NH4N03， 0. 2MgS04:0. 2CaCl2:0. 01FeS04.7H20 :0. 01MnS04 .H20,還包括苯酚，苯酚含量根據(jù)需要量加 入，加蒸餾水定容；
[0011] 制備得到的菌株經(jīng)16SrDNA鑒定為紅球菌屬Rhodococcussp?，革蘭氏染色呈陽 性，脲酶、接觸酶陽性，氧化酶、VP反應和甲基紅反應陰性；在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離單 菌落，淡黃半透明，邊緣整齊，質(zhì)地濕潤，易挑起；所述的紅球菌株C3能以苯酚、吡啶、鄰甲 酸為碳源，其在無機鹽液體培養(yǎng)基中能夠降解l〇〇〇mg/L苯酸。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種利用上述紅球菌株C3生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性組分為上 述的紅球菌株C3。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種利用上述紅球菌株C3生產(chǎn)的微生物菌劑的制備方法，包括 如下步驟：
[0014](1)將所述的紅球菌株C33接種到富集培養(yǎng)基30°C，200r/min條件下培養(yǎng) 24h-48h，以7000rpm速度離心3-5min后得到菌體的對數(shù)生長期細胞，并用磷酸鹽緩沖液洗 滌2~3次；
[0015] (2)將離心出的菌液加入活性炭吸附，其中活性炭加入量為3~10wt%;
[0016] (3)將PVA加入水中，在90°C水浴條件下完全溶解，PVA與水的重量/體積比為 1:8~10,冷卻后加入海藻酸鈉、二氧化硅和碳酸鈣并混合均勻，PVA:海藻酸鈉：二氧化硅： 碳酸鈣的重量比為10:3~6:35:0. 2~0. 5,得到PVA凝膠-海藻酸鈉凝膠；
[0017] (4)把制得的所述PVA-海藻酸鈉凝膠和加入活性炭的菌液混合均勻后，得到菌 體-PVA-海藻酸鈉懸液，將菌體-PVA-海藻酸鈉懸液低速滴入連續(xù)攪拌的含3~5%CaCl2 的硼酸溶液中，所述的硼酸溶液pH呈中性，在4~6°C固定化交聯(lián)24~90h后取出，形成固 定化顆粒；
[0018] (5)將固定化顆粒于固化劑K2HP04固化2_8h后，用去離子水洗滌2~3次，即得 固定化微生物制劑。
[0019] 本發(fā)明還進一步提供了該紅球菌株C3在焦化廢水或煉油廢水或焦油加工廢水中 酚類有機污染物的生物處理中的應用。
[0020] 本發(fā)明還進一步提供了本發(fā)明微生物菌劑在處理含酚廢水中的應用，其中包括以 下操作：將所述的微生物菌劑按重量與體積比為3% -10%的濃度加入含酚廢水中。。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
[0022] 1)本發(fā)明所提供的高效降解菌株源于焦化廠廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥，經(jīng)過 富集馴化及篩選，并通過平板劃線分離純化得到，苯酚等有毒有機物降解效率高。
[0023] 2)本發(fā)明制備固定化微生物制劑的方法簡便，制得的固定化菌劑有效降解菌濃度 高、菌體不易流失、抗沖擊性強。
[0024] 3)與直接投加菌體的生物強化處理工藝相比，具有專一性強、處理效率高、穩(wěn)定性 強、菌種高純高效、污泥量少、固液分離效果好、運行管理簡單、經(jīng)濟性更好等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0025] 圖1是菌劑對焦化廢水中苯酚的降解的效果；
[0026] 圖2是菌劑對焦化加工廢水中苯酚的降解的效果；
[0027] 圖3是菌劑對煉油廢水中苯酚的降解的效果。
【具體實施方式】
[0028] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0029] 實施例1:紅球菌株C3菌株的獲得及鑒定
[0030] -、菌種的獲得
[0031] 菌株源于焦化廠廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥。按1 %接種量吸取2ml污泥樣品 至200ml苯酚濃度為200mg/L的新鮮富集培養(yǎng)基中，搖床震振蕩培養(yǎng)（30°C，200r/min)。富 集瓶混濁后，取2ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到苯酚濃度為400mg/L的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。依次類推，逐 級提高苯酚濃度至l〇〇〇mg/L。將經(jīng)過苯酚濃度為1000mg/L的富集培養(yǎng)基富集后的菌體轉(zhuǎn) 接苯酚濃度為l〇〇〇mg/L無機鹽培養(yǎng)基中馴化。采用稀釋涂布和劃線的方法，在分離培養(yǎng)基 平板上分離篩選以苯酚為唯一碳源和能源的菌株。
[0032] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，具體配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，去離子水 1000ml，苯酚（根據(jù)需要量加入）。無機鹽液體培養(yǎng)基以苯酚為唯一碳源，具體配方： KH2P040 . 5g,K2HP040 . 5g,NH4N031.Og,MgS040 . 2g,CaCl20. 2g,FeS04 ? 7H20 0.Olg,MnS04 ?H20 0. 01g，苯酚（根據(jù)需要量加入），加蒸餾水定容至1L，固體培養(yǎng)基是在此培養(yǎng)基中加入 18~20g瓊脂。
[0033] 二、菌株的鑒定
[0034] (1)形態(tài)特征：菌體為短桿狀
[0035] (2)生理生化特征：革蘭氏染色陽性菌（革蘭氏染色陽性）；脲酶、接觸酶陽性，氧 化酶、VP反應和甲基紅反應陰性；在LB固體培養(yǎng)基上生長3天后，菌落大小約2~3mm，淡 黃色，菌落凸起，邊緣不規(guī)則，菌落表面濕潤，半透明。
[0036] (3)1防rDNA序列鑒定
[0037] 菌株16SrDNA序列比對鑒定：離心收集菌體，用試劑盒提取總DNA。使用16SrDNA 正向引物F1:5 ' -AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3 '，反向引物R1:5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ' 進行DNA擴增（PCR)。PCR反應條件：95°C預變性5min，95°C變性45s，55°C退火45s，72°C 延伸90s，30個循環(huán)，72°C最終延伸10min。所測序列使用NCBIBlast比對分析，結(jié)果顯示， 與其序列相似度達到99%的均為Rhodococcussp.，其16SrDNA序列見序列表。結(jié)合菌株 的生理生化特性，將其歸屬于紅球菌屬（Rhodococcussp.)，編號為C3。
[0038] 實施例2 :紅球菌株RhodococcusC3對無機鹽培養(yǎng)基中R比啶、鄰甲酸的降解
[0039] 挑取紅球菌株C3單菌落于3mlLB液體培養(yǎng)基中，30°C、200r/min振蕩培養(yǎng)24小 時，獲得新鮮菌液。將吡啶、鄰甲酚分別加入無機鹽培養(yǎng)基中，吡啶、鄰甲酚的終濃度分別