膠或其它物理載 體）的表面上。所述變化和更多變化的實例在附錄A-D中論述。
[0139] 所公開方法的修改將通常設(shè)及在凈化期間加入鹽或其它添加劑W防止期望產(chǎn)物 通過與可溶性或不可溶的正電性或負(fù)電性有機(jī)離子的強(qiáng)烈相互作用而發(fā)生損失。
[0140] 因為使用本文中所公開的方法獲得的結(jié)果隨化學(xué)工藝而變，所W應(yīng)理解，雖然所 有的物理形式都能夠?qū)崿F(xiàn)類似結(jié)果，但可能W不同程度的效率、不同的流體體積和不同的 時間間隔來實現(xiàn)。普通技術(shù)人員有能力確定如何有效地針對特定應(yīng)用配置所述方法。
[0141]連施例
[0142] 實施例1.用于執(zhí)行沉淀的化C1濃度的選擇。通過離屯、和膜過濾凈化含有1. 2g/L 單克隆抗肥R2 IgG的1L細(xì)胞培養(yǎng)上清液。運(yùn)種抗體的等電點為約8.6。加入1%尿囊素， 隨后加入0.025%最終濃度的依沙叮晚。通過過濾移除固體。組合相等比例的帶正電的金 屬親合性粒子度ioWorks TREN hi-sub)、帶負(fù)電的金屬親合性粒子煙ielex-100)和帶正 電的疏水性粒子值owex AG 1x2400目）。將20mL粒子混合物裝填入被平衡到大致生理條 件的1. 6x 10cm柱中，并且樣品W 300cm/虹的線性流速流過所述柱。經(jīng)過處理的肥R2包 含165, 66化pm宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)污染。其在抑7下在18%陽G-6000溶液中沉淀。通過經(jīng) 由平均0.22微米孔徑的不帶電膜過濾來移除上清液。沉淀物再懸浮在50mM化pes、18% PEG (pH 7.0)中，并且通過在相同的膜上過濾來移除上清液?？贵w然后在50mM H巧es (pH 7.0)中溶解。在平行實驗中，將化Cl加入到原始樣品中W產(chǎn)生等于200mM的鹽濃度。還 將200mM化C1加入到再懸浮緩沖液中。在另外的平行實驗中，將化C1濃度升高到400、800 和lOOOmMNaCl。測量來自每個實驗的再溶解抗體中的污染性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的濃度。水 平如下：未加入化(：1，16,544口口111;2001111 化(：1，1，984卵111;4001111 化(：1，6051111 化(：1;8001111 NaCl，50wm;1000mMNaCl，3^pm。
[014引實施例2.除了不向原始樣品中加入鹽之外，在800mM化C1下重復(fù)實施例1的實 驗。再溶解的抗體含有155ppm宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。在其中長時間或重復(fù)接觸再懸浮緩沖液 的后續(xù)實驗中，污染性宿主蛋白質(zhì)的濃度降低到約70ppm。運(yùn)突出了W下要點，即當(dāng)初始沉 淀步驟在較高的鹽濃度下執(zhí)行時，性能得到提高。
[0144] 實施例3.實施例2的基本形式，其中不向原始樣品中加入鹽，但是包括在洗涂再 懸浮沉淀物的過程中長時間接觸800mM化C1。隨后用50mMTris、18%陽G(抑8.0)洗涂沉 淀出的IgG，然后將抗體溶解在50mM化is(pH8.0)中。宿主蛋白質(zhì)污染被降低到88ppm; 仍然劣于當(dāng)在高鹽濃度下執(zhí)行初始沉淀時獲得的結(jié)果。
[0145] 實施例4.除了W包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)采集物開始之外，重復(fù)實施例3的實驗。結(jié) 果基本上沒有改變，證明了所述調(diào)節(jié)方法的優(yōu)勢適用于含細(xì)胞的蛋白質(zhì)制劑和不含細(xì)胞的 蛋白質(zhì)制劑兩者。
[0146] 實施例5.重復(fù)實施例3的基本形式，例外是用1M化Cl、50mM化pes(抑7. 0)再溶 解IgG，然后將IgG施加于lOmL的被平衡到相同條件的疏水性陰離子交換劑Captoa化ere 的柱，然后用下降梯度的50mM胎pes(pH7.0)洗脫。在樣品施加后，殘余的PEG流過該柱 并且因此被清除。在梯度下洗脫IgG。洗脫出的IgG中的宿主蛋白質(zhì)污染小于Ippm。運(yùn)個 實施例突出了本文中所公開的方法能夠在僅僅兩個分級分離步驟中實現(xiàn)對被調(diào)節(jié)IgG的 異常高程度的抗體純化。將理解本文中所公開的方法實現(xiàn)所述低水平的宿主蛋白質(zhì)污染的 能力使得許多所述2步程序可行。
[0147] 實施例6.除了在IgG即將再溶解之前W2%的體積比引入DowexAGlx2形式的疏 水性的正電性多孔粒子之外，重復(fù)實施例3的基本形式。宿主蛋白質(zhì)污染被降低到21ppm。 抗體回收率為90%。在平行實驗中，用UNOsphereQ替代Dowex粒子。宿主蛋白質(zhì)的減少 是相同的，但抗體回收率為95 %。
[0148] 實施例7.除了將被凈化的細(xì)胞上清液的鹽濃度升高至1M化C1之外，重復(fù)實施例 6的基本形式。W4%v/v的比例加入UNOsphereQ形式的陰離子交換粒子。使50mMTris、 IM化Cl中的陽G-6000至19 %PEG的最終濃度W沉淀抗體。通過經(jīng)由0. 22微米非離子性膜 過濾來移除上清液。將沉淀物和粒子再懸浮于19%陽G-6000、lM化Cl、50mM化is(pH8.0) 中，并且再次通過過濾移除上清液。沉淀物和粒子然后再懸浮于19%PEG、50mMTris(pH 8.0)中，在攬拌下解育15分鐘，然后通過經(jīng)由相同的過濾器過濾來移除上清液。重復(fù)運(yùn)個 洗涂，然后用50mMTris(pH8.0)溶解抗體。將再溶解的抗體和正電性粒子輕輕地混合30 分鐘W提供酸性宿主蛋白質(zhì)結(jié)合到粒子上的機(jī)會，然后經(jīng)由膜過濾抗體溶液，留下粒子?？?體的宿主蛋白質(zhì)濃度為18ppm?？贵w回收率為93%。
[0149] 實施例8.執(zhí)行一系列實驗，其中在2維矩陣中評估IgG純化和回收率，所述2維 矩陣評估16%、18%、20%和22%的陽6-6000濃度對比0.0、0.5、1.0、1.5和2.01的化(：1 濃度。原材料是通過微濾專口地凈化的含IgG的上清液。IgG回收率、純度和可復(fù)現(xiàn)性W及 陽G濃度之間的變異在約1M化C1是最佳的。1. 5M化C1下的純度是大致相同的，但是回收 率下降。0. 5M化C1下的回收率略微更好，但是純度低于1.0M化C1下的純度。在不存在 化C1的情況下和2.0M化C1下，純度和回收率都嚴(yán)重下降。
[0150] 實施例9.純化IgM的集成方法.通過離屯、和膜過濾凈化含有120mg/L單克隆 IgM克隆529的1L細(xì)胞培養(yǎng)上清液。運(yùn)種抗體的等電點為約6. 0。加入固體氯化鋼W實現(xiàn) 25mS/cm的最終電導(dǎo)率。加入1 %尿囊素，隨后加入0.025%最終濃度的依沙叮晚。通過過 濾移除固體。組合相等比例的強(qiáng)陰離子交換粒子（Macroprep化曲-Q)、帶負(fù)電的金屬親合 性粒子（化elex-100)和強(qiáng)陽離子交換帶電粒子（Macroprep化曲-S)。將20血粒子混合 物裝填入被平衡到大致生理條件的1.6x10cm柱中，并且樣品W200cm/虹的線性流速流過 所述柱。經(jīng)過處理的肥R2包含165,66化pm宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)污染。在對照實驗中，通過用 13%PEG-6000沉淀和在25mS/cm的電導(dǎo)率下洗涂來純化抗體。剩余的宿主蛋白質(zhì)污染為 1383ppm。在平行實驗中，通過相同方法但在47mS/cm的電導(dǎo)率下純化抗體。剩余的宿主蛋 白質(zhì)污染為69ppm。隨后用陰離子交換和陽離子交換色譜純化，運(yùn)將宿主蛋白質(zhì)濃度降低到 小于3ppm〇
[0151] 實施例10.通過加入1 %尿囊素然后加入0.025 %依沙叮晚來調(diào)節(jié)包含 275,357ppm宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、528化pmDNA和13.96%聚集體的含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)采 集物，然后混合 15 分鐘。MacroPrepHi曲Q、Mac;roPrepHi曲S、Mac;roprep1:But5d 和Qielex-lOO度io-RadL油oratories)的均等混合物預(yù)先通過用50mM肥陽S、100mM 化Cl(pH7.0)洗涂來平衡。將經(jīng)平衡的混合粒子W2% (V:V)的量加入不純的IgG制劑， 然后在4-8°C過夜混合。通過微濾移除固體。將1.25mg包被有淀粉的200nm磁性粒子加入 到20血被調(diào)節(jié)的不純的IgG制劑中。在滿旋混合器上在50化pm下混合的同時，逐漸加入 20ml的36%陽G-6000于1.6M化Cl、50mM肥陽S(抑7. 0)中的溶液，W產(chǎn)生18%陽G-6000 和0.8M化C1的最終濃度。滿旋混合繼續(xù)30分鐘，然后用磁性方式收集負(fù)載有IgG的粒 子。用新鮮的50mM肥陽S、0.8M化Cl(pH7. 0)洗涂負(fù)載有IgG的粒子，并且移除洗涂溶 液。移除洗涂緩沖液并且W相同方式再次洗涂粒子。移除洗涂緩沖液，并且將抗體再溶解 于50mM肥陽S、1M化Cl(pH7)中。1血柱裝填有正電性疏水性色譜介質(zhì)（Gaptoa化ere, GEHealthcare)并且被平衡到相同條件。將溶解的IgG施加于柱上，其中結(jié)合的IgG和一 些污染物被認(rèn)為已經(jīng)結(jié)合，同時殘余PEG也結(jié)合。然后施加含有平衡緩沖液的5倍柱體積 的洗涂溶液W更徹底地從系統(tǒng)上移除未結(jié)合的組分。用W50ml肥陽S、300ml化C1(pH 7.0)結(jié)束的10倍柱體積的線性梯度洗脫IgG。W下表格說明純化性能，其中post-con表 示調(diào)節(jié)后，post-NP表示納米粒子后，并且post-CA表示Captoa化ere后。回收率中左側(cè)的 值表示該步驟的回收率，而右側(cè)的值表示先前步驟加該步驟的累積回收率。bid表示檢測極 限W下。更多細(xì)節(jié)請參考Gagnon等人，2014,上述：
[0152]
[0153] 實施例11.通過加入1 %尿囊素、4 %正電性金屬親合性粒子燈REN40 hi曲，Bio-Works)調(diào)節(jié)含有176, 244ppm宿主蛋白質(zhì)污染物和19%聚集體的含IgG的細(xì) 胞培養(yǎng)采集物，在室溫下混合4小時。被移除的用于分析的樣品顯示宿主蛋白質(zhì)被減少到 90, 259ppm并且聚集體被減少到1. 2%。將抑降低到5. 2,加入0. 5%辛酸，并且將混合物解 育2小時。被移除的用于分析的樣品顯示宿主蛋白質(zhì)為1，758ppm并且聚集體為約0. 4%。 經(jīng)由正電性深層過濾器（SartoriusPCI)移除固體。宿主蛋白質(zhì)被減少到135ppm并且聚 集體被減少到小于0. 05%。通過在抑7. 0的18%陽G-6000中沉淀來純化抗體。然后用 1.8M硫酸錠洗涂沉淀物W移除PEG,然后將抗體再溶解于50mMH巧es(pH7.0)中。宿主 蛋白質(zhì)被減少到32ppm。在50mM化is(pH8. 0)下在施加于W空隙排阻模式工作的陰離子 交換色譜柱（UNOsphereQ，Bi〇-Rad)之后，宿主蛋白質(zhì)被減少到小于1卵m。不同之處僅在 于陽G沉淀在800mM化C1的存在下進(jìn)行的平行實驗將宿主蛋白質(zhì)減少到小于Ippm。陰離 子交換步驟將宿主蛋白質(zhì)和聚集體減少到無法檢測的水平。R.Nian等人化化romatogr.A 1282(2013) 127-132)描述了空隙排阻模式下的陰離子交換色譜法。
[0154]實施例12.通過加入1 %尿囊素和0. 025%依沙日丫晚調(diào)節(jié)含有286,OlOppm宿主蛋 白質(zhì)污染物和23%聚集體的含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)采集物，并且在室溫攬拌下解育1小時?；?合 1:1:1 粒子混合物（Qielex-100、Mac;roPreptButyUMacroprepHi曲Q，Bi〇-Rad)，將其 平衡到生理條件，并且將沉降的混合粒子W5%的合并量加入到采集物中，然后在室溫下混 合2小時。宿主蛋白質(zhì)被減少到43, 058ppm并且聚集體被減少到3.4%。在W抑8.0執(zhí)行 的一系列實驗中，通過在獨立實驗中用PEG-6000沉淀來分級分離樣品，在所述獨立實驗中 的濃度為 600mM、800mM、900mM和lOOOmM(lM)。隨后在陽G、50mMl'ris(pH8. 0)中洗涂沉 淀物，此后將抗體再溶解于50mMTris(pH8.0)中。該系列中的宿主蛋白質(zhì)被分別減少到 51、55、45和41ppm。W5%v/v的量將DowexAGlX2(Bi〇-Rad)形式的陰離子交換粒子加 入到每個樣品中，并且混合60分鐘。該系列中的宿主蛋白質(zhì)被減少到16、17、15和13ppm。 執(zhí)行另一系列的實驗，除了初始PEG沉淀在抑7.0下進(jìn)行之外，所有其它細(xì)節(jié)都相同。PEG 步驟之后的宿主蛋白質(zhì)在600mMPfeCl濃度下為44ppm，在800mM濃度下為43ppm，在900mM 濃度下為29ppm，并且在lOOOmM濃度下為31ppm。在Dowex處理之后，宿主蛋白質(zhì)分別被減 少到 20、17、12 和 16ppm。
[01巧]實施例13.通過加入1 %尿囊素和0.025%依沙日丫晚調(diào)節(jié)含有286, 01化pm宿主 蛋白質(zhì)污染物和23%聚集體的含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)采集物，并且在室溫攬拌下解育1小時。 混合粒子的 1:1:1 :1 混合物（Qielex-lOO,MacroPreptButyl，MacroPrepHi曲Q，購自 Bio-Rad)與正電性金屬親合性粒子燈REN40hi曲，購自Bio-Works)，將其平衡到生理條 件，并且將沉降的混合粒子W5%的合并量加入到采集物中，然后在室溫下混合2小時。宿 主蛋白質(zhì)被減少到38,Oeippm并且聚集體被減少到1. 4%。在W抑8. 0執(zhí)行的一系列實驗 中，通過在獨立實驗中用PEG-6000沉淀來分級分離樣品，在所述獨立實驗中化C1的濃度為 600mM、800mM、900mM和lOOOmM(lM)。隨后在陽G、50mMTris(pH8. 0)中洗涂沉淀物，此后 將抗體再溶解于50mM化is(pH8.0