蛋白質(zhì)純化方法
【專利說明】蛋白質(zhì)純化方法
[0001] 巧關申請的聲巧
[0002] 本申請要求2013年2月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/761，646、2013年2月 14日提交的61/764, 966、2013年6月4日提交的61/831，099、2013年7月29日提交的 61/859, 772和2013年11月22日提交的61/907, 877的優(yōu)先權，其各自W全文引用的方式 并入本文中。
【背景技術】
[0003] 重組蛋白的純化通常從凈化步驟開始，其中移除細胞和碎片，使得可W用原本會 因細胞和碎片的存在而受阻礙或變得無效的方法處理剩余上清液。所述移除通常設及 物理方法，例如離屯、和微濾。有時設及使用具有陰離子交換能力的薄膜或深層過濾器， 或直接向含抗體的采集物中加入陰離子交換聚合物或粒子（Gagnon，P.，化rification ToolsforMonoclonalAntibodies,ValidatedBiosystems,Tucson, 1996 ; Kuczewski，M.等人，BiopharmInt. 23 (3H2010) 20-25 ;Kuczewski，M.等人，Biotechnol. J.，6 (201]_) 56-6巧DGan等人化QiromatographyA191 (2013)33-40)最近指出，用可溶形 式和不可溶形式的多價有機離子針對性地移除染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物特別支持對細胞培養(yǎng) 采集物的有效調(diào)節(jié)。物理凈化方法通常無法實現(xiàn)顯著的染色質(zhì)減少。向采集物中加入陰離 子交換粒子典型地移除大約一半的DM。Gan等人（上文）所描述的一些方法移除99%的 染色質(zhì)，并且可W精確地被認為是針對染色質(zhì)的凈化方法。
[0004] 已經(jīng)描述了通過用聚乙二醇（陽G)沉淀來純化蛋白質(zhì)。其典型地作為水相技術 來執(zhí)行，其中PEG溶于水性蛋白質(zhì)制劑中并且引起蛋白質(zhì)從該溶液中沉淀出來。PEG的 尺寸和濃度是已知的工藝參數(shù)，抑也是一樣佑a即〇nl996上文；D.Atha,K.等人J.Biol Chem.，256(1981) 12108-12117 ;美國專利申請公開號2008/0214795,其各自W引用的方式 并入本文中）。操作抑越接近抗體的等電點，實現(xiàn)沉淀所需的PEG濃度就越低。已指出非 蛋白沉淀鹽如氯化鋼（NaCl)的濃度對選擇性幾乎沒有顯著影響（Atha等人，上文），但是 所述技術已經(jīng)在高達約1. 7M濃度（10% )的化C1的存在下執(zhí)行（Gervais等人，美國專利 申請公開號2010/0204455)。也已經(jīng)證實了當PEG與高濃度的化C1組合時，由PEG介導的空 間排阻色譜實現(xiàn)更高的IgG回收率和更低的污染物含量，并且進一步注意到其在很大程度 上抵消了抑的影響化Ga即on等人，J.Qiromatogr,A1324(2014) 171-180)。也已經(jīng)描述了 將PEG與蛋白質(zhì)沉淀鹽憐酸鋼組合（Gervais，上文；美國專利號4, 379, 086和4, 515, 776)。
[0005] 在使沉淀物再溶解之后移除殘余PEG對于所述技術來說是一項重大挑戰(zhàn)。 Kuczewski等人（上文）通過在其中IgG結合于陽離子交換柱而在PEG流過的條件下進行 陽離子交換色譜來移除殘余PEG。陽G的移除原本是復雜的，因為其占據(jù)與其被用于沉淀的 蛋白質(zhì)相同的尺寸范圍（作為流體動力學半徑或直徑測量）。運導致尺寸排阻色譜、透析和 滲濾的標準方法無法用于PEG移除。針對IgG單克隆抗體廣泛實施的在流過模式下的陰離 子交換色譜也不適合，因為PEG與抗體一起流過。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在一些方面，本文中公開的實施方案設及用于從蛋白質(zhì)制劑純化期望蛋白質(zhì)的方 法，其包括：通過用可溶性有機多價離子、固定化有機多價離子或兩者處理，任選地在過飽 和尿囊素的存在下處理，由此來調(diào)節(jié)（condition)所述蛋白質(zhì)制劑，從而移除至少90%的 染色質(zhì)，然后（1)在大于生理濃度的非蛋白質(zhì)沉淀鹽的存在下用非離子性有機聚合物沉淀 期望蛋白質(zhì)W提供期望蛋白質(zhì)的沉淀物，或（2)在不存在大于生理濃度的非沉淀鹽的情況 下用非離子性有機聚合物沉淀期望蛋白質(zhì)W提供沉淀物，隨后在大于生理濃度的非蛋白質(zhì) 沉淀鹽的存在下用非離子性有機聚合物洗涂沉淀物，其中沉淀或洗涂步驟任選地在大體上 不存在蛋白質(zhì)沉淀鹽的情況下和任選地在沒有將期望蛋白質(zhì)的抑調(diào)節(jié)到期望蛋白質(zhì)的等 電點的0. 5個抑單位W內(nèi)的值的情況下進行；和任選地在不存在非離子性有機聚合物的情 況下用蛋白質(zhì)沉淀鹽洗涂沉淀物，其中沉淀鹽W足夠保持期望蛋白質(zhì)處于沉淀狀態(tài)的濃度 存在。
【具體實施方式】
[0007] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在其中90%或更多的染色質(zhì)和染色質(zhì)代謝分解產(chǎn)物被移除但是 抗體保持溶解的條件下，使包含抗體的蛋白質(zhì)制劑接觸可溶性有機多價離子和/或固定在 固體表面上的有機多價離子來調(diào)節(jié)所述包含抗體的蛋白質(zhì)制劑，運W出乎意料的高程度 提高了PEG沉淀法進行分級分離的能力。例如，在調(diào)節(jié)步驟使來自宿主蛋白質(zhì)的污染減 少30-70%時，其驚人地導致隨后的PEG沉淀步驟進一步減少宿主蛋白質(zhì)污染的能力增加 400-500%或更高，尤其當沉淀配方還含有過量的非沉淀鹽時。運突出了W下要點，即針對 染色質(zhì)的凈化方法并不是僅僅是通過減少總體污染物負荷、而是通過移除會干擾隨后的純 化步驟的污染物來幫助隨后純化的。還觀察到，在沉淀期間存在濃度高于正常生理水平的 鹽會顯著降低并且在一些情況下實際上消除了將操作抑調(diào)節(jié)到或使操作抑接近于期望蛋 白質(zhì)的等電點的需求。用包含濃度足W使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的蛋白質(zhì)沉淀鹽但不含PEG的最 終洗涂液洗涂所沉淀的期望蛋白質(zhì)提供了在使期望蛋白質(zhì)再溶解之前移除PEG的額外優(yōu) 勢。運些特征的各種組合明顯地導致調(diào)節(jié)步驟與沉淀步驟的組合能夠將宿主細胞污染降低 到低于通過高性能方法如生物親和色譜所實現(xiàn)的水平。于是，運允許所公開的方法在抗體 再溶解之后僅經(jīng)過單個另外的分級分離步驟即可實現(xiàn)足W支持被純化的期望蛋白質(zhì)的體 內(nèi)使用的純化水平。實驗數(shù)據(jù)證明該集成方法廣泛適用于IgG和IgM抗體。其有效地純化 IgM抗體的能力表明其適用于純化非抗體蛋白質(zhì)。本文中所公開的方法的多個方面與國際 專利申請?zhí)朩0 2013180650、W0 2013180649和W0 2013180655中所公開的方法結合使用， 所述申請各自W全文引用的方式并入本文中。在一個或多個實施方案中，用有機多價離子 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括使樣品與正電性有機添加劑接觸。在一些所述實施方案中，正電性有 機添加劑包括選自由依沙日丫晚（ethacridine)、亞甲藍、十六烷基=甲基漠化錠組成的群組 的至少一種。在一些所述實施方案中，此類物質(zhì)的濃度或物質(zhì)組合的總計濃度在0. 001 %到 1 %、或0. 01 %到0. 1 %、或0. 02%到0. 05%的范圍。在一些所述實施方案中，制劑的抑可 被調(diào)高到不會引起期望蛋白質(zhì)的回收率明顯降低的堿性值。在其中期望蛋白質(zhì)是IgG單克 隆抗體的一個所述實施方案中，pH可W被調(diào)節(jié)到比抗體等電點低半個抑單位的抑值，或 者當實驗結果表明抗體回收率可接受時被調(diào)節(jié)到更高，但是所述調(diào)節(jié)不是必需的。如果在 升高的鹽濃度的存在下進行任何抑調(diào)節(jié)，那么在蛋白質(zhì)等電點的約0. 5到約1. 0個抑單 位W內(nèi)、或約1. 5個抑單位W內(nèi)、或約2. 0個抑單位W內(nèi)的抑值將是足夠的。
[0008] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括使樣品與負 電性有機添加劑接觸。在一些所述實施方案中，負電性有機添加劑包括選自由庚酸、辛酸、 辛締酸、壬酸、壬締酸、癸酸、甲基藍組成的群組的至少一種。在一些所述實施方案中，此類 物質(zhì)的濃度或物質(zhì)組合的總濃度在0. 001 %到10%、或0. 01 %到1 %、或0. 1 %到0. 5%的 范圍。在一些所述實施方案中，制劑的抑可被調(diào)節(jié)降低到不會引起期望蛋白質(zhì)的回收率明 顯降低的酸性值。在一些所述實施方案中，制劑的抑可被調(diào)節(jié)到3. 5到6. 5、4. 0到6. 0、 4. 5到5. 5、5. 0到5. 3、5. 15到5. 25的范圍，或調(diào)節(jié)到5. 2或另一個中間值。
[0009] 在一個或多個前述實施方案中，正電性多價有機離子和負電性多價有機離子可被 用于調(diào)節(jié)制劑。在一些所述實施方案中，正電性多價有機離子在負電性多價有機離子之前 接觸制劑。在一些所述實施方案中，正電性多價有機離子是約0. 01%濃度的十六烷基=甲 基錠，負電性多價有機多價離子是約0.4%濃度的壬酸。在一些所述實施方案中，可W在調(diào) 節(jié)的任何階段存在約1%到約2%的尿囊素。在一些所述實施方案中，經(jīng)過調(diào)節(jié)的制劑的聚 集體含量是其中首先加入負電性多價有機離子的制劑中的聚集體含量的大約=分之一到 四分之一。
[0010] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括使樣品與不 溶解的尿囊素接觸。在一些所述實施方案中，存在于蛋白質(zhì)制劑中的經(jīng)加入的尿囊素可W 合計為約0. 6%到50%、或0. 7%到20%、或0. 8%到10%、或0. 9%到5%、或1 %到2%、 或中間值。
[0011] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括使樣品與濃 度低于臨界膠束濃度的非離子性或兩性離子表面活性劑接觸。
[0012] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括：（i)提供 第一組分，其是具有負電性表面的第一固體基質(zhì)；（ii)使蛋白質(zhì)制劑與第一組分接觸，其 中操作條件大體上防止期望蛋白質(zhì)結合到第一組分上；和（iii)使具有降低的染色質(zhì)含量 的期望蛋白質(zhì)與第一組分分離。在一些所述實施方案中，第一負電性表面可W伴隨有第二 負電性表面。
[0013] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括：（i)提供 第一組分，其是具有正電性表面的第一固體基質(zhì)；（ii)使蛋白質(zhì)制劑與第一組分接觸，其 中操作條件大體上防止期望蛋白質(zhì)結合到第一組分上；和（iii)使具有降低的染色質(zhì)含量 的期望蛋白質(zhì)與第一組分分離。在一些所述實施方案中，第一正電性表面攜帶有2(氨乙 基）胺的殘基。在一些所述實施方案中，第一正電性表面可W伴隨有第二正電性表面。
[0014] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括：（i)提供 第一組分，其是具有正電性表面的第一固體基質(zhì)；（ii)提供第二組分，其是具有負電性表 面的第二固體基質(zhì)；（iii)使蛋白質(zhì)制劑與第一組分和第二組分接觸，其中第一組分和第 二組分被配置成使得蛋白質(zhì)制劑可W同時接觸運兩種組分，其中操作條件大體上防止期望 蛋白質(zhì)結合到第一組分或第二組分上；和（iv)使具有降低的染色質(zhì)含量的期望蛋白質(zhì)與 第一組分和第二組分分離。在一些所述實施方案中，第一正電性表面攜帶有2 (氨乙基）胺 的殘基。
[0015] 在一個或多個前述實施方案中，用有機多價離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)制劑包括：（i)使蛋 白質(zhì)制劑與包含至少一種結合在表面上的能夠結合金屬的配體的至少一種固體表面接觸， 其中結合在表面上的能夠結合金屬的配體起初大體上不含金屬，其中選擇操作條件W大體 上防止期望蛋白質(zhì)結合到所述至少一種固體表面上，和（ii)使蛋白質(zhì)制劑與至少一種結 合在表面上的配體分離。
[0016] 在一個或多個前述實施方案中，已經(jīng)用可溶性的正電性或負電性有機添加劑和/ 或攜帶有負電性、正電性或金屬親合性配體的固體表面處理的蛋白質(zhì)制劑可W隨后流過某 種裝置，該裝置的流體接觸表面包含正電荷。
[0017] 在一個說明針對染色質(zhì)的凈化方法的應用的實施方案中，W1% (v/v)的量將尿 囊素加入到細胞培養(yǎng)采集物中。細胞培養(yǎng)物可W包含細胞，或者細胞可W預先已經(jīng)被移除。 加入亞甲藍，使其濃度為0. 025% (w/v)?；蛘?，可W加入依沙日丫晚，使其濃度為0. 025%。或 者，可W加入十六烷基=甲基漠化錠，使其濃度為0.025%?；蛘?，可W使用0.025%組合濃 度的運些或其它正電性有機添加劑的組合。然后將混合物在攬拌下解育2小時。W2-5% v:v的量加入攜帶有正電性金屬親合性配體2(氨乙基）胺（TREN)的粒子。將混合物在攬 拌下解育4小時，然后通過任何方便的手段移除固體。包含期望蛋白質(zhì)的剩余溶液可W任 選地流過深層過濾器，所述深層過濾器在其流體接觸表面上攜帶有正電荷。
[0018] 在另一個說明針對染色質(zhì)的凈化方法的應用的實施方案中，W1% (v/v)的量將 尿囊素加入到細胞培養(yǎng)采集物中。細胞培養(yǎng)物可W包含細胞，或者細胞可W預先已經(jīng)被移 除。加入0.6%庚酸?；蛘呒尤?.4%辛酸?；蛘呒尤?.3%壬酸?；蛘呒尤?.2%癸酸。 或者加入0.5%甲基藍。或者，可W使用運些或其它負電性有機添加劑的組合。然后將混合 物在攬拌下解育2小時。W2-5%v:v的量加入攜帶有正電性金屬親合性配體2 (氨乙基） 胺（TREN)的粒子。將混合物在混合下解育4小時，然后通過任何方便的方法移除固體。包 含期望蛋白質(zhì)的剩余溶液可W任選地流過深層過濾器，所述深層過濾器在其流體接觸表面 上攜帶有正電荷。
[0019] 在一個或多個前述實施方案中，可W將鹽加入到凈化混合物中W防止期望