] 實施例7 提取方法包括以下步驟： ① 藥材預處理：將紫錐菊地上部分粉碎過60目篩；加入脫脂溶劑，脫脂后，將脫脂溶劑 于60°C條件下?lián)]干，處理后的藥材備用； ② 提?。悍Q?、偬幚淼玫降乃幉膌〇〇g，加入1500g水，調pH為3,預熱至60°C后，加入 5g酶制劑，酶解時間60min，80°C滅酶10min，在80°C繼續(xù)攪拌保溫Ih; ③ 濃縮：離心，將上清液旋蒸減壓濃縮至生藥量1 :1的濃縮液； ④ 醇沉：向濃縮液中加入3倍的無水乙醇，4°C條件下靜置24小時； ⑤ 洗滌：將④得到的醇沉液抽濾，得到的沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌； ⑥ 干燥：將沉淀物用2倍量的水復溶，在150°C的條件下噴霧干燥得到紫錐菊多糖。
[0030] 其中，所述脫脂溶劑為石油醚、1，2-環(huán)氧丙烷、乙醚的混合，其質量份數(shù)比為： 1. 5:0. 07:0. 05。
[0031] 其中，酶制劑為1.36g纖維素酶、2. 95g果膠酶、0. 58g蝸牛酶、0. 14g植酸酶的混 合。
[0032] 一、得到的紫錐菊多糖的活性成分分析 多糖的處理過程： ①預處理：將多糖制成5mg/mL的溶液，用Sevage法除蛋白，用大孔樹脂AB-8冷浸法脫 色ld〇
[0033] ②純化：采用DEAE-Cellulose(DE-52)層析柱，以NaCl溶液梯度洗脫。
[0034] ③樣品收集：以硫酸苯酚法檢測各管多糖含量，依據(jù)洗脫曲線合并峰位，濃縮，透 析。
[0035] ④干燥：將透析液濃縮，冷凍干燥得到紫錐菊純凈組分。
[0036] I. 1材料與儀器 I.I. 1材料與試劑 實驗所需的材料與試劑見表1-1。
[0037]表1-1實驗材料與試劑
I. 1. 2儀器與設備 實驗所需的儀器與設備見表1-2。
[0038] 表1-2實驗儀器與設備
1.2實驗方法 1. 2. 1多糖分子量測定 本部分采用高效液相色法測定各EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量。色譜條件： 流動相：〇.lmol/LNaNOj^#液； 流速：1. 〇ml/min; 柱子：ShodexOHpak806 和 802 串聯(lián)； 檢測器：示差折光檢測器（Optilabrex)和激光檢測器（DAWNHELE0S-II)聯(lián)用（美國 懷雅特公司）； 樣品前處理：用流動相溶解稀釋至5000ppm進樣。
[0039]L2. 2XRD分析 將EPPSI、EPPSII、EPPSIII壓于樣品架上進行X射線多晶衍射測定。條件：陶瓷X光 管，Cu靶，額定電壓40kV，額定電流50mA，掃描范圍2 0 5-60。
[0040] 1. 2. 3紅外分析 將KBr干燥后取適量與500yg純化樣品EPPSI、EPPSII、EPPSIII混合，在紅外燈下 于瑪瑙研缽中研磨均勻至無晶粒，用10X107壓力在壓油機上壓5min，取壓的薄片在紅外 光譜儀與400-4000cm-l范圍內掃描，記錄光譜數(shù)據(jù)和光譜圖。
[0041] 1.2.4核磁共振 稱取多糖組分30mg分別溶于0. 5mLD2O中，進行IHNMR及13CNMR核磁分析。
[0042] 1. 3實驗結果與分析
[0043]I. 3. 1多糖分子量測定
[0044]EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量測定結果分別見圖1、2、3。
[0045]由圖 1至 3,可見EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量分別為 21. 5KDa、12.OKDa、 13.OKDa。分子量的不同可能導致活性的差異，因此有必要進一步研究制得的EPPSI、EPPS II、EPPSIII的活性。
[0046]I. 3. 2XRD分析
[0047]EPPSI、EPPSII、EPPSIII的XRD分析結果見圖 4。
[0048]由圖4可見，EPPSI、EPPSII、EPPSIII在2 0為24左右有弱的衍射峰，幾乎為 無定形區(qū)，說明它們結晶度低，均處于無定形狀態(tài)。EPPSII的衍射峰強些，可能較EPPSI、 EPPSIII其結晶性好些。 1. 3. 3紅外分析 EPPSI、EPPSII、EPPSIII的紅外分析分別見圖5、6、7。 由圖5至7可知，EPPSI、EPPSII、EPPSIII的基團非常相似。圖5中3371. 9cm-l為O-H的伸縮振動，說明分子中含羥基。2933. 27cm-l為C-H伸縮振動。1152. 76、 1080. 21、1026. 52cm-l三個峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，是其糖苷鍵C-O-C的非對稱振動 峰，在669. 51cm-l處為吡喃糖環(huán)C-O-C的對稱振動峰。說明EPPSI為吡喃糖。圖6中 3400. 72cm-l為O-H的伸縮振動，說明分子中含羥基。2936. 81cm-l為C-H伸縮振動。圖6 中3431. 66cm-l為O-H的伸縮振動，說明分子中含羥基。2937. 81cm-l為C-H伸縮振動。 1. 3. 4核磁共振
[0049] 1. 4 小結 本部分實驗通過簡單的波譜分析得到以下結論：（1)EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子 量分別為 21. 5KDa、12. 0KDa、13. 0KDa。（2)EPPSI、EPPSII、EPPSIII的結晶度都很低， 均處于無定形狀態(tài)。（3)紅外表明EPPSI、EPPSII、EPPSIII的結構相似，EPPSI特征峰較 明顯為吡喃糖。（4)EPPSI的核磁結果證明了EPPSI為吡喃糖，且發(fā)生C-l、C-6取代。
[0050] 二、制備得到的紫錐菊多糖的免疫活性研究 本實驗以小鼠NK細胞和小鼠單核巨噬細胞RAW264. 7為對象，研究紫錐菊多糖的免疫 活性。
[0051] 2. 1實驗材料 2. I. 1材料與試劑 實驗所需的材料與試劑見表2-1。
[0052] 表2-1實驗材料與試劑
2.I. 2儀器與設備 實驗所需的儀器與設備見表2-2。
[0053] 表2-2實驗儀器與設備
2. 2實驗方法 2. 2. 1對NK細胞活性影響 NK細胞為自然殺傷細胞，是機體重要的免疫細胞，具有非特異性殺傷作用，在免疫系統(tǒng) 中發(fā)揮著重要的作用。不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關，而且在某些情況下參與 超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。K562是白血病細胞，處于高度未分化階段，從白血病 急變期的患者的胸水中分離建立的。K562是NK細胞的敏感高度敏感的體外靶標。檢測NK 細胞的殺傷活性經常用它做靶細胞。
[0054]MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的 琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan)并沉積在細 胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在570nm測 定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。
[0055] 小鼠脾臟在體內IL-3誘導下可促進NK細胞的分化。本部分實驗以從小鼠脾臟中 分離NK細胞為效應細胞，以K562細胞為靶細胞，采用MTT比色法檢測細胞數(shù)確定NK細胞 對靶細胞K562的殺傷率。
[0056] 2. 2.I.1小鼠脾細胞懸液的制備 脫頸處死小鼠，75%酒精浸泡消毒2-3min，超凈臺內取脾臟，用PBS沖洗1次，然后于 150目篩網(wǎng)中研磨，邊研磨邊加入20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，過篩至50mL離心管中。800 rpm，離心5min，棄上清，加入Tris-MMCl緩沖液5mL，吹打均勾，靜置3-4min。1000rpm 離心5min，棄上清，用5mL含1%P/S的PBS洗2次，用5mlRPMI1640洗1次，臺盼藍染色、 計數(shù)，棄上清，用10%FBS、1%P/S的RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度至5X106/mL，待用。
[0057] 2. 2. L 2靶細胞的制備 K562細胞置離心管中，1200rpm/min，離心 3min，用 10%FBS、1%P/S的RPMI1640完全 培養(yǎng)液調整成濃度為5XIO5Ail的細胞懸液。
[0058] 2. 2.I. 3NK細胞活性的測定 將小鼠脾細胞懸液加入96孔板中，每孔5〇1^，再依次加入含￡??54??3 14??3 11、EPPSIII50、100、250yg/ml的RPMI1640 完全培養(yǎng)液，各做 4 復孔。于 37 °C、5%C02培養(yǎng)箱 培養(yǎng)12h后，加入K562細胞懸液50y1，同時設設空白對照組、靶細胞對照組及效應細胞對 照組。再培養(yǎng)24h后棄上清，每孔加入0.5mg/mL的MTT50yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加 入DMS0150yL，培養(yǎng)Ih后，在微孔板快速振蕩器上振搖5min，使藍紫色甲瓚結晶充分溶 解，用酶標儀測定各孔在570nm處的吸光度值。結果以NK細胞殺傷率表示，NK細胞殺傷 率按公式（5-1)計算： NK細胞活性（％) = [1-(實驗組OD57toni-效應細胞對照組OD57toni) /靶細胞對照組OD值]X100% (5-1) 2. 2. 2對RAW264. 7細胞活性影響 RAW264. 7是小鼠單核巨噬細胞是單核-巨噬細胞具有多方面的生物功能，主要可以 概括為以下幾個方面：①非特異免疫防御。當外來病原體進入機體后，在激發(fā)免疫應答前就 可被單核-巨噬細胞吞噬清除，但少數(shù)病原體可在其胞內繁殖。②清除外來細胞。③非特 異免疫監(jiān)視。④遞呈抗原。即當外來抗原進入機體后，首先由單核一巨噬細胞吞噬、消化， 將有效的抗原決定簇和MHCII類分子結合成復合體，這種復合體被T細胞識別，從而激發(fā)免 疫應答。⑤分泌介質IL-1、干擾素、補體（CUC4、C2、C3、C、B因子）等。
[0059] 本部分實驗以RAW264. 7為研究對象，通