人類cyp2c19基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，設(shè)及一種人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)特異 性引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP2C19是CYP450家族中最重要的藥物代謝酶之一，許多內(nèi)源性底物、W及臨床 上大約2%的藥物都由其催化代謝。研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19可影響到氯化格雷、奧美拉挫、地西 泮、苯妥英鋼等許多重要臨床應(yīng)用藥物的代謝，而其基因多態(tài)性是引起個(gè)體間和種族間對(duì) 同一藥物表現(xiàn)出不同代謝能力的原因之一。2010年美國(guó)FDA要求氯化格雷藥物標(biāo)簽上注明 CYP2C19與療效的關(guān)系，并建議使用前檢測(cè)CYP2C19基因型。
[0003] CYP2C19 基因野生型為CYP2C19*1/*1 型，CYP2C19*2 型、CYP2C19*3 型和 CYP2C19*17是中國(guó)人群中較常見(jiàn)的等位基因型，其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起 CYP2C19基因編碼的酶活性喪失，代謝底物的能力減弱，使血藥濃度增高，從而引起與血藥 濃度相關(guān)的藥物不良反應(yīng)，攜帶者稱為弱代謝者，中國(guó)人群中的弱代謝者99%為*2和*3型 等位基因。CYP2C19*17型可引起CYP2C19基因編碼的酶活性增強(qiáng)，代謝底物的能力增強(qiáng)，攜 帶者稱為快代謝。對(duì)于藥物代謝慢的人群，長(zhǎng)期按正常劑量服用，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重毒副作用： 主要是肝損害、造血系統(tǒng)損害、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。因此CYP2C19基 因多態(tài)性在氯化格雷的治療中也起著重要的作用，CYP2C19基因多態(tài)性如表1所示。
[0004]表1
[0005]
[0006]目前針對(duì)基因多i性的檢iu方法很多，直接測(cè)序法，I焦磯酸測(cè)序法，高分辨率溶 解曲線檢測(cè)法化i曲ResolutionMeltingAnalysis,HRM)，巧光定量PCR法等。其中最常 見(jiàn)方法為測(cè)序法，該方法費(fèi)用較低，但操作耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對(duì)設(shè)備 要求比較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統(tǒng)巧光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛， 但該方法檢測(cè)基因多態(tài)性一般采用Genotyping方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)樣本數(shù)量W及多 態(tài)性分布有一定要求，樣本量少時(shí)不能對(duì)樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。因此，需要建立一 種快速有效的檢測(cè)少量樣本的CYP2C19基因多態(tài)性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種人類CYP2C19基因 多態(tài)性的檢測(cè)引物和試劑盒，w此解決現(xiàn)有基因多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)中，樣本量少時(shí)基因多態(tài) 性檢測(cè)效果不理想的問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物，其中，所述引物的 核巧酸序列分別為SEQIDNO: 1-9所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其中，所述試劑盒含有本 發(fā)明所提供的特異性引物。
[0010] 所述試劑盒還包括2組特異性探針序列，其中第1組特異性探針序列的核巧酸序 列如SEQIDNO: 10與SEQIDNO: 11所示；第2組特異性探針序列的核巧酸序列如SEQID NO: 12與SEQIDNO: 13所示；第3組特異性探針序列的核巧酸序列如SEQIDNO: 14與SEQ IDNO: 15所示，且所述巧光定量PCR探針的5'端有FAM或VIC修飾，3'端有NFQ-MGB修飾。
[0011] 本發(fā)明人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒采用化qman探針?lè)?，建立了在同?反應(yīng)管檢測(cè)同一基因兩種不同多態(tài)性的多重巧光定量PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明CYP2C19基因 多態(tài)性檢測(cè)試劑盒采用ARMS引物特異性擴(kuò)增目的模板與SNP探針特異性檢測(cè)目的模板方 法，對(duì)特異性檢測(cè)同一基因兩種多態(tài)性提供雙重保證，同時(shí)引入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)和UNG酶防污染 系統(tǒng)，能更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定地對(duì)樣品進(jìn)行分型檢測(cè)。本發(fā)明的試劑盒具有W下優(yōu)點(diǎn)；1.可W準(zhǔn) 確檢測(cè)單個(gè)樣品的基因型；2.可W準(zhǔn)確檢測(cè)Ing基因組DNA的基因型；3.針對(duì)CYP2C19的 基因型設(shè)計(jì)ARMS引物和SNP分型探針，可W特異性擴(kuò)增識(shí)別對(duì)應(yīng)的多態(tài)性；4.使用巧光定 量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程均為閉管反應(yīng)，顯著降低污染，并且加入U(xiǎn)NG酶防污染系統(tǒng)， 確保結(jié)果真實(shí)可信點(diǎn).在同一反應(yīng)管中檢測(cè)同一基因兩種多態(tài)性，操作簡(jiǎn)便，能在90分鐘 內(nèi)完成檢測(cè)結(jié)果判讀方法簡(jiǎn)單客觀，便于分析。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為CYP2C19*2G/G純合野生樣本30例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0013] 圖2為CYP2C19*2A/A純合突變樣本5例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0014] 圖3為CYP2C19*2G/A雜合突變樣本15例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0015] 圖4為CYP2C19*3G/G純合野生樣本28例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0016] 圖5為CYP2C19*3A/A純合突變樣本6例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0017] 圖6為CYP2C19*3G/A雜合突變樣本16例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0018] 圖7為CYP2C19*17C/C純合野生樣本36例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0019] 圖8為CYP2C19*17T/T純合突變樣本1例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖9為CYP2C19*17C/T雜合突變樣本3例，其中一個(gè)檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，W下結(jié)合 附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施僅僅用W 解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)特異性引物，其中， 所述引物的核巧酸序列如SEQIDNO: 1-9所示。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種用于人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其中，所述試劑 盒含有本發(fā)明所提供的特異性引物，該試劑盒還包括PCR緩沖液，特異性探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，HotStartTaq酶，UNG酶。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR緩沖液中含有1. 0~5.OmM的MgCls，1. 0~ 5.OmM的dNTPs，即dATP、加TP、dGTP和dCTP各 1. 0 ~5.OmM。
[00巧]所述3組特異性引物序列為SEQIDN0:1、SEQIDN0:2與SEQIDN0:3;SEQID N0:4、SEQIDN0:5 與SEQIDN0:6;SEQIDN0:7、SEQIDN0:8 與SEQID側(cè):9;其中569 IDNO: 1 與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4 與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7 與SEQIDNO:8 為普 通PCR引物，分別擴(kuò)增包含CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17基因多態(tài)性的DM片段； 其中SEQIDNO: 3、SEQIDNO:6與SEQIDNO:9為ARMS引物，用于分別特異性擴(kuò)增含有 CYP2C19*2密碼子CCG的DM片段、CYP2C19*3密碼子TGG與CYP2C19*17C變成T的DM片 段。3條ARMS引物分別在3'模板堿基與待擴(kuò)增類型的堿基配對(duì)。
[0026] 各引物序列列舉如下；
[0027]
[0029] 在本發(fā)明所提供的試劑盒中，可選的，所述特異性探針5'端修飾有FAM或VIC，3' 端修飾有非巧光澤滅基團(tuán)NFQ(Non-FluorescentQuencher)，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生巧光，因此 可W大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)該特異性探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可W將該探 針的Tm值提高10°C左右，因此同樣的Tm值，MGB探針可W比普通化qman探針設(shè)計(jì)的更短， 使得探針在識(shí)別具有單個(gè)核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，特異性更強(qiáng)。
[0030] 優(yōu)選地，所述2組特異性探針序列分別為SEQIDNO: 10與SEQIDNO: 11 ;SEQID NO: 12 與SEQIDNO: 13;SEQIDNO: 14 與SEQIDNO: 15 且其中SEQIDNO: 10 與 SEQID NO: 11 探針?lè)謩e特異性檢測(cè)CYP2C19*2G、CYP2C19*2A模板DM;SEQIDNO: 12 與 SEQID NO: 13 探針?lè)謩e特異性檢測(cè)CYP2C19*3G、CYP2C19*3A模板DM;SEQIDNO: 14 與 SEQID NO: 15探針?lè)謩e特異性檢測(cè)CYP2C19*17C、CYP2C19*17T模板DM;
[0031] 各探針序列列舉如下：
[0032]
[003引在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，由于待檢測(cè)的樣品中的某些成分可能導(dǎo)致PCR出現(xiàn) 部分或完全抑制，故使用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)該巧光定量PCR反應(yīng)是否存在抑制；此外，擴(kuò)增儀可 能存在高于允許范圍的孔間差，導(dǎo)致不同管間擴(kuò)增效率差異；另外人為加樣錯(cuò)誤也可能導(dǎo) 致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此本發(fā)明實(shí)施例中采用內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)來(lái)消除上述隱患，保證了檢測(cè)結(jié) 果的準(zhǔn)確性。該內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)優(yōu)選包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針，本發(fā)明實(shí)施例中也可采用本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的其它內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)。
[0034] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)包含內(nèi)標(biāo)引物、內(nèi)標(biāo)探針和內(nèi)標(biāo)模板。序列為SEQIDN0:16 和SEQIDNO: 17,所述內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQIDNO: 18,所述內(nèi)標(biāo)探針5'端修飾有R0X，3' 端修飾有B冊(cè)2。
[0035] 優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)針對(duì)人類基因組序列設(shè)計(jì)，其中包含的內(nèi)標(biāo) 引物序列和內(nèi)標(biāo)探針如下所示：
[0036]
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例中的內(nèi)標(biāo)探針5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)，為R0X，3'端標(biāo)記有不發(fā)光 巧光澤滅基團(tuán)，如B冊(cè)2等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的巧光能量被澤滅基團(tuán)吸 收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在DNA鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探 針，其5' - 3'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離巧光澤滅基團(tuán)，產(chǎn)生巧光 信號(hào)。因此檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度就代表了模板DM的拷貝數(shù)。
[0038] 優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的酶溶液中含有Taq酶，其為PCR反應(yīng)所必需，且該酶溶 液還含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycos5dase)酶為尿喀晚-N-糖基化酶，其特點(diǎn)是最 佳活性溫度為50°C，95°C滅活，其作用原理是選擇性水解斷裂含有加的雙鏈或單鏈DNA中 的尿喀晚糖巧鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈。在PCR反應(yīng)中，使用UNG酶可預(yù)防非特異性 PCR擴(kuò)增和污染。
[0039] 優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例中的檢測(cè)試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液，設(shè)置陽(yáng) 性對(duì)照和空白對(duì)照可監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行，所述陽(yáng)性對(duì)照液中含有本發(fā)明中 設(shè)及的CYP2C19*2 兩種多態(tài)性CYP2C19*2G，CYP2C19*A，CYP2C19*3 兩種多態(tài)性CYP2C19*3G， CYP2C19*3A,CYP2C19*17 兩種多態(tài)CYP2C19*17C,CYP2C19*17T，6 種質(zhì)粒DNA混合液，該質(zhì)粒 可為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的質(zhì)粒，該6種質(zhì)粒濃度相同，均為2500拷貝/yl;所述空白對(duì) 照液為Tris-HCl(lOmM)緩沖液。
[0040] 本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種人類CYP2C19基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，該 檢測(cè)方法包括W下步驟：
[00川 （1)獲得待測(cè)樣品基因組DNA;
[0042] (2)利用特異性引物、特異性探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)。
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