一種鎘-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種簡-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] IgG主要由脾、淋己結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，W單體形式存在。在個體發(fā)育過程 中機(jī)體合成IgG的年齡要晚于IgM，在出生后第3個月開始合成，3~5歲接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清總Ig的75 %。IgG是唯一能通過胎盤的Ig，在自 然被動免疫中起重要作用。此外IgG還具有調(diào)理吞瞻、ADCC和結(jié)合SPA等作用。由于IgG 上述特點(diǎn)，IgG在機(jī)體免疫防護(hù)中起著主要的作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒、抗毒素抗體都屬于 IgG類抗體。應(yīng)用對麻疹、甲型肝炎等有免疫力的產(chǎn)婦或正常人丙種或胎盤球蛋白可進(jìn)行人 工被動免疫，能有郊地預(yù)防相應(yīng)的傳染性疾病。
[0003] 簡是一種常見的有毒金屬及環(huán)境污染物，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，包括電鍛、 制造工業(yè)顏料、塑料穩(wěn)定劑、鑲簡電池等，與人們生活息息相關(guān)。對于普通人群，主要是通過 吸入簡污染的空氣，及食用含簡污水灌概農(nóng)田生產(chǎn)的農(nóng)作物（如含簡大米）等方式攝入簡。 當(dāng)然，吸煙也是慢性簡吸入的另一重要來源。
[0004] 越來越多的研究證明簡具有分子毒性作用，可引起人和動物的肺、肝、腎等多種器 官W及屯、血管、免疫、神經(jīng)等多系統(tǒng)功能損傷，還具有較強(qiáng)的致癌作用。1993年國際腫瘤研 究機(jī)構(gòu)（IARC)已將簡及其化合物列為第1類人致癌物。各國學(xué)者進(jìn)行的流行病學(xué)、動物 及人的實(shí)驗(yàn)中，皆認(rèn)為簡與肺癌、前列腺癌、腎癌、乳腺癌、消化系腫瘤等多系統(tǒng)腫瘤發(fā)生相 關(guān)。之后各國學(xué)者就簡致癌的分子機(jī)制又進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)簡可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、抑制 DNA修復(fù)、促使DNA異常甲基化、干擾多種基因表達(dá)、影響細(xì)胞周期調(diào)控、抑制細(xì)胞調(diào)亡、促 進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生等多種方式致機(jī)體損傷，甚至造成腫瘤的發(fā)生。簡致機(jī)體損傷的機(jī)制及其 復(fù)雜，但在該些眾多的致機(jī)體損傷的方式中，大部分是由于簡與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合，影響相關(guān) 蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)，W及其功能的實(shí)現(xiàn)，因而研究簡與蛋白質(zhì)的結(jié)合對于理解簡的毒性、 其對機(jī)體損傷的機(jī)制W及簡致腫瘤的機(jī)制具有重要意義。
[0005] 雖然目前可W運(yùn)用多種方法檢測出血簡含量，但是關(guān)于簡中毒的評價，僅能通過 檢測血簡、尿簡、發(fā)簡含量等方式，間接反應(yīng)人體內(nèi)的循環(huán)簡含量、機(jī)體簡負(fù)荷等，無法進(jìn)一 步評估簡對于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，簡與人體的關(guān)系也日益 緊密，因而尋找一種可W從機(jī)體功能角度評價簡中毒，特別是慢性簡中毒對于機(jī)體的損害 程度的評價方式日益重要。
[0006] 綜合W上，關(guān)于簡中毒，特別是慢性簡中毒的評價，僅能通過檢測血簡含量，間接 反應(yīng)人體內(nèi)的循環(huán)簡含量，無法進(jìn)一步評估簡對于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù) 的飛速發(fā)展，簡與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可W從機(jī)體功能角度評價簡中毒， 特別是慢性簡中毒對于機(jī)體的損害程度的評價方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對簡污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種簡-IgG馨合物及其制備方 法，并建立簡-IgG馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測簡-IgG馨合物在評價一個 地區(qū)簡污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中簡-IgG馨合物可W間接反映 該個地區(qū)人群受簡污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)簡污染程度。
[000引本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是；提供一種簡-IgG馨合物，簡離子與IgG通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的簡-IgG馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0010] A)簡與IgG的馨合反應(yīng)；在人源的IgG中加入簡離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0011] B)純化簡-IgG馨合物的提??；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgGW及多余的簡離子，即得簡-IgG馨合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0013] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使簡-IgG馨合物 復(fù)溶；
[0014] 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgG特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[00巧]做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgG與 填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0017] 妨收集；收集經(jīng)過步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[001引 （6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地20透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與簡特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0022] (10)收集；收集經(jīng)過步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得簡-IgG馨合物。
[0024] 其中，上述簡-IgG馨合物的制備方法，還包括步驟C);對簡-IgG馨合物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下；
[0026] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的簡-IgG馨合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[00測 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4)檢測；在膠床上找出含簡的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法檢測是否含有簡W及檢測簡的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的簡-IgG馨合物在制備檢測人體內(nèi)簡-IgG馨合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的簡-IgG馨合物作為對照品的試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgG的蛋白或捕獲金屬 簡的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測簡-IgG馨合物的方法，W已知含量的上述的簡-IgG 馨合物作為對照品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純簡-IgG馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純簡-IgG馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純簡-IgG馨合物與電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 實(shí)施本發(fā)明的簡-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明首次體外合成簡-IgG馨合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出簡-IgG馨合物可用于制備檢測血樣中簡-IgG馨合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0037] 3.本發(fā)明建立了簡-IgG馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測簡-IgG馨合 物在評價一個地區(qū)簡污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中簡-IgG馨合物 可W間接反映該個地區(qū)人群受簡污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)簡污染程度。本發(fā)明 建立的簡-IgG馨合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提 局。
【附圖說明】
[003引圖1為本發(fā)明所述的簡-IgG馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的簡-IgG馨合物的同步福射X線電泳條帶的巧光分析圖；
[0040] 其中，圖1中，M為Marker, 5為簡-IgG馨合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中簡金屬能量。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0043] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0045] 本發(fā)明中的所述能與IgG特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲IgG的蛋白的娃 膠或樹脂；
[0046] 本發(fā)明中的能捕獲IgG的蛋白（抗IgG抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgG H&L，其品牌為Abeam、型號為油6715 ;
[0047] 本發(fā)明中的能與簡特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲簡的物質(zhì)的硅膠或樹 脂；
[0048] 本發(fā)明中的能捕獲簡金屬的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗CdmAb，購買自己傲德生物 技術(shù)公司炬ioWorldInc)、貨號為AP7015;
[0049] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0化0] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[005U 洗漆液為含有KH2PO40. 2mg/ml、化2冊04? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[005引封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[005引 稀釋緩沖液為含1. 5mg/mL化20)3、2. 93mg/mlNaHC03的PH為9.6的0. 05M磯酸 鹽緩沖液；
[0054] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0055] 終止液為：將21. 7ml的2MH2SO4定容至200ml的d地2〇中；
[0化6] 洗脫液為含l-2mg/ml