堿5ng、維生 素B12 5ng、肌醇3ng、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白30ng、腐胺20ng、重組人血清白蛋白700ng、谷胱甘肽 100yg、維生素C10yg、維生素E12yg、氯化鈣36yg、氯化鉀200yg、氯化鈉20mg、檸檬 酸鐵1ug。
[0033] 組成3:在每1ml的DMEM培養(yǎng)液中含有生長激素500ng、皮質(zhì)醇25ng、胰島素 15 yg、甘氨酸14yg、精氨酸16yg、蘇氨酸15yg、絲氨酸35yg、亮氨酸30yg、異亮氨酸 22yg、L-賴氨酸14yg、蛋氨酸40yg、L-酪氨酸35yg、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子250ng、成纖維 細(xì)胞生長因子150ng、肝細(xì)胞生長因子75ng、葉酸55ng、d-泛酸媽23ng、氯化膽堿10ng、維 生素B12 10ng、肌醇5ng、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白40ng、腐胺25ng、重組人血清白蛋白1000ng、谷胱 甘肽130yg、維生素C12yg、維生素E15yg、氯化鈣40yg、氯化鉀300yg、氯化鈉30mg、 檸檬酸鐵1ug。
[0034] 上述的無血清培養(yǎng)基通過如下方式使用：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞初代在牛血清 DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，傳代至5代（共計(jì)培養(yǎng)18 天，每三天更換一次培養(yǎng)基），檢測培養(yǎng)基組成和干細(xì)胞增殖情況，如表1所示。
[0035] 表1 :傳代5代的BM-MSC增殖情況
[0037] 由上述可見，本發(fā)明所得培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基可用于穩(wěn)定、高效 的增殖培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，所得人間充質(zhì)干細(xì)胞無污染，品質(zhì)好。
[0038] 在上述實(shí)驗(yàn)過程中，作為對比，以同樣的方式申請人使用了含有牛血清的培養(yǎng)基 對上述干細(xì)胞進(jìn)行全程的增殖傳代，發(fā)現(xiàn)其盡管具有更好的增殖效率（DPT更短），但其所 得干細(xì)胞傳代產(chǎn)物存在顯著的牛血清污染，在進(jìn)行觀察時(shí)需要對其進(jìn)行特定的紅色染料染 色才能較好的對增殖產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和觀察。以同樣質(zhì)量的培養(yǎng)基質(zhì)量而論，牛血清培養(yǎng)基 的商品成本大約為本發(fā)明無血清培養(yǎng)基的5-7倍。
[0039] 在上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，申請人也曾對本領(lǐng)域近期出現(xiàn)的無血清培養(yǎng)基的性能進(jìn) 行了監(jiān)測，例如CN103805562A公開的無血清培養(yǎng)基，用于增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞盡管具有較 好的效率，但是所得干細(xì)胞品質(zhì)較差，鏡下可觀察到較為明顯的干細(xì)胞聚集混濁情況，顯示 出該技術(shù)方案在設(shè)計(jì)時(shí)為對干細(xì)胞增殖效率進(jìn)行有效的調(diào)控。
[0040] 實(shí)施例2
[0041]以上述組成2的無血清培養(yǎng)基為例，分別對脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞以細(xì)胞培養(yǎng)基（含DMEM、10v/v%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺）進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，然后 以本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)體系獲得的細(xì)胞形態(tài)，并檢測其活 性。
[0042] 如圖1所示，分別顯示了脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞a、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞b傳代過 程中每代的細(xì)胞形態(tài)變化，顯示了本發(fā)明無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)品質(zhì)好、分布較為均勻。
[0043] 參考圖2所示，表示的干細(xì)胞增殖形態(tài)圖像中粗糙結(jié)構(gòu)區(qū)域（即傳代干細(xì)胞無序 增殖和聚集）在整體中的面積分?jǐn)?shù)，該結(jié)果顯示本發(fā)明的無血清培養(yǎng)增殖干細(xì)胞粗糙結(jié)構(gòu) 區(qū)域遠(yuǎn)低于1%，顯示出本發(fā)明傳代培養(yǎng)增殖干細(xì)胞品質(zhì)非常理想。
[0044] 參考圖3所示，顯示了采用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基增殖人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞 倍增時(shí)間DPT變化趨勢，上述變化趨勢顯示采用本發(fā)明的培養(yǎng)基具有良好的增殖效率。
[0045] 參考圖4所示，顯示了早期1-2代脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞a、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 b傳代到5-6代后的活性變化，通過流式細(xì)胞儀分析早期和晚期的活性變化，細(xì)胞活性基本 無降低。
[0046] 實(shí)施例3
[0047] 一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清懸浮培養(yǎng)基，組成如下：在每1ml的DMEM 培養(yǎng)液中含有生長激素200ng、皮質(zhì)醇25ng、胰島素14yg、甘氨酸12yg、精氨酸12yg、蘇 氨酸12yg、絲氨酸35yg、亮氨酸27yg、異亮氨酸20yg、L-賴氨酸10yg、蛋氨酸35yg、 L_酪氨酸30yg、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子200ng、成纖維細(xì)胞生長因子120ng、肝細(xì)胞生長因子 60ng、葉酸40ng、d-泛酸媽20ng、氯化膽堿5ng、維生素B12 5ng、肌醇3ng、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋 白30ng、腐胺20ng、重組人血清白蛋白700ng、谷胱甘肽100yg、維生素C10yg、維生素E 12yg、氯化鈣36yg、氯化鉀200yg、氯化鈉20mg、檸檬酸鐵1yg、聚氧乙烯-聚氧丙烯共 聚物lmg。
[0048] 實(shí)施例4
[0049] 一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清懸浮培養(yǎng)基，組成如下：在每1ml的DMEM 培養(yǎng)液中含有生長激素300ng、皮質(zhì)醇25ng、胰島素12yg、甘氨酸12yg、精氨酸15yg、蘇 氨酸12yg、絲氨酸30yg、亮氨酸30yg、異亮氨酸20yg、L-賴氨酸9yg、蛋氨酸40yg、 L_酪氨酸30yg、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子100ng、成纖維細(xì)胞生長因子100ng、肝細(xì)胞生長因子 40ng、葉酸50ng、d-泛酸媽20ng、氯化膽堿5ng、維生素B12 10ng、肌醇2ng、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋 白40ng、腐胺20ng、重組人血清白蛋白1000ng、谷胱甘肽100yg、維生素C10yg、維生素E 10yg、氯化媽 40yg、氯化鉀 200yg、氯化鈉 20mg、朽1 檬酸鐵 1yg、Cytodex?2. 5mg。
[0050] 基于同樣的實(shí)驗(yàn)方法，對實(shí)施例3、4公開的無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖人間充 質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了研宄，發(fā)現(xiàn)在不降低細(xì)胞增殖品質(zhì)的情況下，可以顯著改善細(xì)胞倍增時(shí)間 DPT，改善細(xì)胞的增殖效率，改善的程度平均在40%的水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于以DMEM培養(yǎng)液作為基 礎(chǔ)培養(yǎng)基，在DMEM培養(yǎng)液中加入有全營養(yǎng)組分：氨基酸、維生素、蛋白營養(yǎng)素、無機(jī)鹽；調(diào)控 組分：糖代謝激素、生長因子、抗氧化劑，各成分的用量為在Iml的DMEM培養(yǎng)液中，糖類代 謝激素10-20 y g、氨基酸120-250 y g、生長因子200-500ng、維生素40-100ng、蛋白營養(yǎng)素 500-1200ng、抗氧化劑 100-180 y g、無機(jī)鹽 8-35mg。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于糖類代謝激素以胰島素為主要成 分，輔之以胰島素反調(diào)節(jié)激素，胰島素的用量為12-15 yg，胰島素反調(diào)節(jié)激素的用量為 50-600ng〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于氨基酸至少包含一種或幾種必需氨基 酸，和一種或幾種半必需氨基酸；必需氨基酸包括蘇氨12-15 y g、亮氨酸24-30 y g、異亮氨 酸18-22 y g、賴氨酸9-14 y g、蛋氨酸30-40 y g ;半必需氨基酸包括甘氨酸8-14 y g、精氨酸 9-16 y g、絲氨酸 30-35 y g、酪氨酸 28-35 y g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于生長因子包括內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 80-260ng、成纖維細(xì)胞生長因子100-150ng、肝細(xì)胞生長因子40-75ng。5. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于維生素包括葉酸20-55ng、d-泛酸鈣 17_23ng、氯化膽堿 3-10ng、維生素 B12 3-10ng、肌醇 l_5ng。6. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于蛋白營養(yǎng)素包括重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白 15-40ng、腐胺20-25ng、重組人血清白蛋白500-1100ng。7. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于抗氧化劑包括谷胱甘肽90-130 y g、維 生素 C 10-13 yg、維生素 E 10-15 yg。8. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于無機(jī)鹽包括氯化鈣33-40 y g、氯化鉀 70-300 y g、氯化鈉 10-30mg、檸檬酸鐵 0? 8-1 y g。9. 根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，其特征在于還加入有pH指示劑，其用量為 0. l-〇. 5mg〇10. -種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清懸浮培養(yǎng)基，其特征在于在權(quán)利要求1的 無血清培養(yǎng)基中加入表面活性劑和/或微載體作為懸浮載體，懸浮載體的用量為0. 5-5mg。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以DMEM培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在DMEM培養(yǎng)液中加入有全營養(yǎng)組分：氨基酸、維生素、蛋白營養(yǎng)素、無機(jī)鹽；調(diào)控組分：糖代謝激素、生長因子、抗氧化劑。本發(fā)明所公開的無血清培養(yǎng)基能夠以較低的成本用于培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，為其提供全面的營養(yǎng)，并有效調(diào)控其成長，使得人間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有良好的活性，改善了間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程，避免間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中對動物血清的需求，降低動物蛋白的殘留及動物來源病毒污染的可能性。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN104962516
【申請?zhí)枴緾N201510430188
【發(fā)明人】龔偉
【申請人】龔偉
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月20日