一種rhIL-10重組載體構建及其蛋白提純的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及蛋白純化技術領域，具體涉及一種rhIL-ΙΟ重組載體構建及其蛋白提純的方法。
【背景技術】
[0002]在體外將目的基因與載體結合成一具有自我復制能力的重組體，繼而通過轉化大腸桿菌，篩選出含有目的基因的轉化子細菌，再進行擴增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝，即重組克隆或表達載體的構建。構建完畢的質?？蛇M行酶切及測序鑒定，得到與目的基因相符且沒有突變的重組載體，將其轉化大腸桿菌感受態(tài)進行誘導表達。蛋白誘導表達后進行分離純化，鑒于rhIL-ΙΟ在非融合系統(tǒng)中表達量低或不表達，因此后期采用融合系統(tǒng)進行誘導表達，并成功創(chuàng)新性的利用了 IMPACT表達系統(tǒng)，分離純化得到rhIL-10。
[0003]白細胞介素1(ILlO)是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，其功能包括免疫抑制和免疫促進兩方面，可調(diào)節(jié)多種免疫細胞的分化和增殖，同時也具有調(diào)節(jié)免疫刺激的特性。
[0004]RGD多肽(⑶CRGDCFC，9肽)能夠特異性結合在成體中相對缺乏的ανβ3、ανβ5整合素，此兩種整合素在血管發(fā)生中會選擇性上調(diào)升高，因此，RGD是新生血管內(nèi)皮細胞特異性識別并結合的多肽序列。將新生血管內(nèi)皮特異性結合的RGD導向肽與IL-10融合表達，可以降低用藥劑量及治療成本，減用藥帶來的毒副作用；同時在體內(nèi)能夠使IL-10藥物定向作用于血管內(nèi)皮細胞而發(fā)揮藥理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種rhIL-ΙΟ重組載體構建及其蛋白提純的方法，建立了適宜重組蛋白rhIL-ΙΟ的表達載體，并利用此表達載體進行目的蛋白的純化，檢測其具有生物活性；該重組蛋白增加了 hIL-ΙΟ在體內(nèi)的靶向性，賦予了蛋白具有抗腫瘤以及機體免疫功能的活性，更為重要的是其在傷口愈合過程中能夠與新生血管內(nèi)皮細胞特異靶向結合，從而預防抑制瘢痕纖維化的形成。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:一種hIL-ΙΟ重組載體，其特征在于，采用MPACT系統(tǒng)表達，其融合蛋白標簽為6個組氨酸^XHis)的重組載體，如重組載體的質粒圖譜所示。
[0007]一種hIL-ΙΟ重組載體的構建、表達及鑒定方法，包括以下步驟:
[0008]( 一 )rh-1L10 基因的擴增
[0009]I)總RNA的提取
[0010]正常人外周血經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，PBS洗滌2次，重懸于10%PRMI1640培養(yǎng)液，加入終濃度為10g/L的ConA，置5% 0)2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)48h，收集細胞，根據(jù)Sigma RNA抽提試劑盒方法，提取總RNA，_80°C保存?zhèn)溆茫?br>[0011 ] 2) RNA反轉錄及IL-10 cDNA的擴增
[0012]利用Takara公司反轉錄試劑盒，按照說明進行RT-PCR反應:第一步去除基因組DNA，5XgDNA Eraser Buffer 2 μ I, gDNA Eraser I μ I, Total RNA 500ng, Rnase FreedH20 加至 10 μ 1，42°C溫育 2min ;第二步反轉錄，分別加入 PrimeScript RT Enzyme MixI I μ I, RT Primer Mixl μ 1，5XPrimeScript Buffer 24μ1，第一步反應液 10 μ 1，RnaseFree dH20 加至 20 μ 1，37°C溫育 30min，85°C反應 3min 后得到 cDNA。
[0013]( 二 )重組載體的構建、表達及其鑒定
[0014]l)pTWINl-1L10表達載體的構建
[0015]按大腸桿菌慣用密碼子設計RGD基因序列、引物及相應的酶切位點，合成如下2條引物F1、R1 ；
[0016]RGD 導向肽氨基酸序列如下:H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH ；
[0017]RGD 基因序列:5’ tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3’ ；
[0018]Fl:5' GCTCTTCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAG3' BspQI
[0019]Rl:5' CTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACGGCAATCACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3' PstI
[0020]以Fl、Rl 為引物，cDNA 為模板，隨之按 95°C 1s 預變性，95 °C 30s, 55 °C 30s，72 °C Imin，30個循環(huán)后72 °C進行延伸5min，得到PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物及pTWINl載體分別經(jīng)BspQI/Pst I雙酶切，回收目的片段進行連接，連接產(chǎn)物轉化DH5a，挑取單克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定，得到pTWINl-1LlO-RGD表達載體；
[0021]2)pTWINl-his-1L10 表達載體的構建
[0022]帶有his標簽his-1L10-R⑶擴增引物:
[0023]F2:5’ CGCAACATATGCATCATCATCATCATCATAACAACGGTAACAACGGTCTCG3’ NdeI/6 Xhis
[0024]R2:5，AACTGCAGTCAACAGAAACAATCACCACG 3，PstI
[0025]以F2、R2為引物，pTWINl-1LlO-RGD為模板，隨之按95 °C 1s預變性，95 0C 30s,60 °C 30s, 72 °C 1.2min，30 個循環(huán)后 72 °C 進行延伸 5min，得到 PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物及pTWINl-1L10-RGD載體分別經(jīng)Ndel/PstI雙酶切，回收目的片段進行連接，連接產(chǎn)物轉化Rosetta，挑取單克隆，抽提質粒，酶切鑒定，進一步經(jīng)測序鑒定，構建成pTWINl-his-1LlO-RGD表達載體的工程菌；
[0026]3)rhIL-10重組蛋白在大腸桿菌中的表達
[0027]上述工程菌pTWINl-his-1L10-RGD/Rosetta接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，次日以1% (v/v)的接種量接種到含有氨芐青霉素和氯霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，培養(yǎng)液光密度0D600為0.6時，加入ImM IPTG繼續(xù)培養(yǎng)5hr誘導表達，離心收集菌體；
[0028]4)rhIL_10蛋白表達的檢測及鑒定
[0029]將誘導表達的菌體培養(yǎng)物離心，收集菌體，采用12%的SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物，IPTG誘導與未誘導樣相比，在分子量相應處有一條明顯的深染新生蛋白帶，與預計融合蛋白的分子量大小相符。將蛋白從凝膠電轉移至PVDF膜上，常規(guī)Western blot分析，ECL發(fā)光，可見一明顯顯色帶，分子量一致，未誘導菌株，標準蛋白及表達菌中其它條帶無陽性反應。
[0030]rh-1L10融合蛋白的純化方法，包括以下步驟:
[0031]I)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的粗提
[0032]取誘導表達的菌體20g，用 200ml 裂解液(1mM Tris-Cl, pH8.5 ；lmM EDTA, pH8.0)，磁力攪拌器充分攪拌15min后，加入200 μ I溶菌酶(50 μ g/ml)，充分攪拌15min，4°C靜置Ihr，取樣50 μ 1，12000rpm離心5min，上清中加入2 X 1adingbuffer混勾，沉淀中加入 50 μ I ddH20 重懸，加入 2 X loading buffer 混勾。廢水煮 5min，12000rpm 離心 5min，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)表達的融合蛋白存在于沉淀中，說明誘導表達的重組蛋白是以包涵體形式存在的；
[0033]2)包涵體洗滌
[0034]第一步，加入0.1% (w/v)脫氧膽酸鈉(DOC)，繼續(xù)加入ImM MgCl2，加入2.5 μ g/ml DNA酶(Dnase I)，磁力攪拌器充分攪拌20min，取樣50 μ I后靜置lOmin，4°C離心，12000rpm/min，離心 20min，棄上清；
[0035]第二步，加入200ml裂解液，0.5% DOC(w/v)進行洗滌，磁力攪拌器攪拌15min，取樣 50 μ I 后靜置 lOmin, 4°C離心，12000rpm/min,離心 20min，棄上清；
[0036]第三步，加入200ml裂解液，0.5% Triton Χ-100 (v/v)，磁力攪拌器攪拌15min，取樣 50 μ I 后靜置 lOmin, 4°C離心，12000rpm/min,離心 20min，棄上清；
[0037]第四步，重復上一步操作；
[0038]3)包涵體溶解
[0039]第一步，400ml溶解液(0.1M Tris-Cl (pH 10.0) ,0.1M NaCl，8M 尿素，1mM 2-巰基乙醇(β -ME))溶解包涵體，磁力攪拌器攪拌1.5hr，4°C靜置過夜；
[0040]第二步，將上述溶解液12000rpm離心20min，收集上清；
[0041]第三步，將上清裝入透析袋，用pH8.0溶解液不含β -ME透析24_36hr，換液2_3次，離心收集上清；
[0042]4)融合蛋白 his-1ntein-1L10-RGD 的純化
[0043]取GE 公司鎮(zhèn)柱基質 NI Sepharose Fast Flow 裝柱，柱體積 5.4X 15cm，用 ρΗ8.0溶解液不含β -ME平衡，上樣后分別用含0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3Μ咪唑ρΗ8.0溶解液線性梯度洗脫，收集各個峰樣品，SDS-PAGE鑒定；
[0044]5)融合蛋白his-1ntein-1L10-RGD的復性及自切割
[0045]于4°C時，在復性緩沖液的逐漸稀釋下緩慢復性，在pH6.0緩沖液中融合蛋白his-1ntein-1L10