菌液atp含量和od比值在發(fā)酵和發(fā)酵劑制備中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌株發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地，涉及一種在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)測(cè)定菌液ATP 含量和OD值的比值以判斷發(fā)酵終點(diǎn)的方法，以及該方法在菌株保存，特別是在制備乳酸菌 發(fā)酵劑中的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵劑的制備方法，以及由該方法制備的發(fā)酵劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 在乳酸菌飲料或是干酪或是其他發(fā)酵制品生產(chǎn)的過(guò)程中，高品質(zhì)的直投式發(fā)酵劑 是保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提。直投式發(fā)酵劑制備的過(guò)程主要包括了菌體的高密度發(fā)酵及發(fā)酵劑 的冷凍制備兩個(gè)部分。而這個(gè)過(guò)程中的諸多因素都會(huì)對(duì)終產(chǎn)品發(fā)酵劑的性能造成影響，比 如，發(fā)酵的條件、發(fā)酵收獲時(shí)間，冷凍操作過(guò)程等。
[0003] 發(fā)酵劑對(duì)于菌體的要求首先是具有高活性。其次是要有較高的耐受性，而并不僅 僅局限于對(duì)菌數(shù)的要求。在現(xiàn)有的發(fā)酵劑的生產(chǎn)過(guò)程中一般都是通過(guò)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中的pH 值，0D600值等數(shù)據(jù)指標(biāo)，以判斷最適宜的菌種收獲時(shí)間。但通過(guò)常規(guī)的判斷方法所制備的 發(fā)酵劑不能夠得到菌體最理想的狀態(tài)，并且發(fā)酵劑的制備時(shí)間較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服以上缺陷，一方面，提供了一種菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該 方法包括：將菌株接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，測(cè)定菌液的 ATP含量和OD值的比值，并使其達(dá)到頂點(diǎn)，以結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。
[0005] 第二方面，本發(fā)明還提供了如上所述的方法在菌株保存中的應(yīng)用。
[0006] 第三方面，本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照如上 所述的方法對(duì)用于制備發(fā)酵劑的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液。
[0007] 第四方面，本發(fā)明還提供了由以上方法制備的發(fā)酵劑。
[0008] 通過(guò)上述技術(shù)方案，在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程，測(cè)定菌液的ATP含量和OD值的比值，以該 比值達(dá)到頂點(diǎn)時(shí)作為發(fā)酵培養(yǎng)的終點(diǎn)以結(jié)束發(fā)酵過(guò)程。采用該方法培養(yǎng)得到的菌體具有較 高的活性和耐受性，且該時(shí)間點(diǎn)要早于通過(guò)單純測(cè)定0D600值或是監(jiān)測(cè)活菌數(shù)判斷得到的 收獲時(shí)間點(diǎn)，因此，具有更短的發(fā)酵時(shí)間，并且，將這樣的菌體保存后再次用于發(fā)酵時(shí)能夠 表現(xiàn)出優(yōu)越的發(fā)酵性能。
[0009] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是保藏號(hào)為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中菌液ATP含量 隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線。
[0012] 圖2是保藏號(hào)為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中菌液pH值和 OD值隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線。
[0013] 圖3是保藏號(hào)為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的菌液ATP/0D 值隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人在研宄的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，ATP普遍存在于所有活的生物體中，被用來(lái) 貯存和傳遞化學(xué)能，在微生物菌體中也不例外，微生物死亡后，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，其體 內(nèi)的ATP會(huì)被很快的降解掉；而對(duì)于一定生理時(shí)期內(nèi)的活體微生物，其體內(nèi)的ATP會(huì)保持在 一個(gè)較為恒定的水平。而ATP作為一種能量的載體，同時(shí)也反應(yīng)了菌體內(nèi)能量代謝水平的 情況，菌體內(nèi)含有的ATP含量越高，代表了菌體處于一個(gè)更活躍的能量代謝狀態(tài)。而對(duì)于乳 酸菌來(lái)說(shuō)，其產(chǎn)生ATP的途徑主要是通過(guò)葡萄糖或乳糖向乳酸轉(zhuǎn)化的過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，ATP含量 越高，代表了葡萄糖向乳酸轉(zhuǎn)化效率越高，表征了此時(shí)菌體具有更高的發(fā)酵活性。
[0016] 基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人試圖通過(guò)在菌體培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)測(cè)定菌體體 內(nèi)ATP的含量，當(dāng)其達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)，結(jié)束發(fā)酵以進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵劑的制備，而不是通過(guò)常規(guī) 的通過(guò)測(cè)定OD值或是pH的方法，當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)數(shù)末期時(shí)結(jié)束發(fā)酵，以進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵劑的 制備。但通過(guò)這樣的方法制備得到的發(fā)酵劑性能的改善程度并沒有達(dá)到預(yù)期的效果，并且 制備時(shí)間較長(zhǎng)。
[0017] 本發(fā)明的發(fā)明人又發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中，分別測(cè)定菌體體內(nèi)ATP的含量以及 OD值，并計(jì)算兩者的比值，也即，得到單位菌體密度的ATP含量，通過(guò)以該比值達(dá)到頂點(diǎn)為 基準(zhǔn)，來(lái)判斷發(fā)酵終點(diǎn)。這樣基本上保證了每個(gè)菌體細(xì)胞內(nèi)的ATP含量均處于一個(gè)最佳的 水平。以該方法制備得到的發(fā)酵劑的性能能夠得到提高。例如，通過(guò)如上方法判斷發(fā)酵培 養(yǎng)的終點(diǎn)，能夠使菌體達(dá)到最大的活性，并且得到的菌體對(duì)環(huán)境也具有較高的耐受性，將這 樣的菌體保存后再次用于發(fā)酵時(shí)能夠表現(xiàn)出優(yōu)越的發(fā)酵性能。并且采用該方法能夠提早結(jié) 束發(fā)酵過(guò)程，使得發(fā)酵時(shí)間縮短，帶來(lái)了較高的社會(huì)效益。
[0018] 基于以上發(fā)現(xiàn)，一方面，本發(fā)明提供了一種菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法，該方法包括：將 菌株接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，測(cè)定菌液的ATP含量和OD 值的比值，并使其達(dá)到頂點(diǎn)，以結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"頂點(diǎn)"并非是嚴(yán)格意義上指代的一個(gè)特定的具體點(diǎn)值，其根據(jù) 培養(yǎng)菌株的不同，培養(yǎng)條件的不同以及對(duì)所述頂點(diǎn)要求程度的不同而會(huì)在一定的范圍內(nèi)有 所差別。所述頂點(diǎn)即可以理解為菌液中ATP的含量和OD值的比值的頂點(diǎn)值，也可以理解為 當(dāng)菌液中ATP的含量和OD值的比值達(dá)到頂點(diǎn)值時(shí)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，確定菌液的ATP含量和OD值比值達(dá)到頂點(diǎn)的方法沒有特別的限制， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用常規(guī)的方法進(jìn)行確定。例如，可以在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中較粗略的 獲得該頂點(diǎn)：具體的，在菌體發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)間隔取樣或是在線時(shí)時(shí)監(jiān)控的方法， 測(cè)定培養(yǎng)液中ATP的含量以及OD值，計(jì)算得出培養(yǎng)液中ATP的含量和OD值的比值，待觀察 到的比值剛有所下降時(shí)立即結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)，該時(shí)間點(diǎn)便為所述頂點(diǎn)。其中，當(dāng)通過(guò)間隔取樣 的方法確定所述頂點(diǎn)時(shí)，當(dāng)所述比值在上升緩慢階段時(shí)，可以適當(dāng)?shù)目s短取樣的間隔。還 例如，可以通過(guò)提前繪制曲線的方法精確獲得所述頂點(diǎn)，具體的，將同一菌株進(jìn)行預(yù)發(fā)酵培 養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件與正常培養(yǎng)時(shí)完全相同，在培養(yǎng)的過(guò)程中通過(guò)間隔取樣或 是在線時(shí)時(shí)監(jiān)控的方法，測(cè)定培養(yǎng)液中ATP的含量以及OD值，計(jì)算得出培養(yǎng)液中ATP的含 量和OD值的比值，然后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，ATP的含量和OD值的比值為縱坐標(biāo)繪制發(fā)酵 曲線，從而得到所述頂點(diǎn)。
[0021] 其中，所述ATP的含量和OD值的測(cè)定方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的測(cè)定方法，例如，可 以使用微生物細(xì)胞活力分析儀（Microbial Cell Viability Assay)并按照其說(shuō)明書進(jìn)行 ATP含量的測(cè)定，可以通過(guò)常規(guī)的分光光度計(jì)或是酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值的測(cè)定。
[0022] 其中，微生物細(xì)胞活力分析儀是通過(guò)如下的原理進(jìn)行檢測(cè)的：
[0023] ATP生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶E和Mg2+的作用下，熒光素 LH與ATP發(fā)生 腺苷?；换罨?，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，形成了熒光素一AMP復(fù)合體，并放出 焦磷酸。該復(fù)合體被分子氧所氧化，形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物Ρ*-Ε · AMP，放出CO2，當(dāng)該復(fù)合物從 激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光，從而被儀器檢測(cè)到。
[0024] 本發(fā)明對(duì)待培養(yǎng)的菌株沒有特別的限制，由于采用本發(fā)明的方法可以獲得活性和 耐受性較高的培養(yǎng)菌株，并且在后期使用時(shí)，所述獲得的培養(yǎng)菌株能夠較快的進(jìn)入狀態(tài)并 積極發(fā)揮活性。因此，本發(fā)明的方法特別適用于需要進(jìn)行保存的任何菌株的培養(yǎng)，待培養(yǎng)結(jié) 束后，可以進(jìn)行常規(guī)的保存，例如，甘油管的保存，制備成凍干粉的保存等等。
[0025] 在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述菌株為乳酸菌菌株，優(yōu)選的，所述乳酸 菌菌種包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根 據(jù)本發(fā)明一種具體的實(shí)施方式，所述乳酸菌為保藏號(hào)CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0026] 因此，第二方面，本發(fā)明提供了如上所述的方法在菌株保存中的應(yīng)用。
[0027] 所述菌株可以為任何需要保存的菌株。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述菌株為乳酸菌菌株，優(yōu)選的，所述乳酸菌菌株包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧 桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明一種具體的實(shí)施方式，所述乳酸菌為保藏 號(hào)CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0028] 另外，第三方面，本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照 如上所述的方法對(duì)用于制備發(fā)酵劑的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液。
[0029] 根據(jù)