用于cdr移植的接受體框架的制作方法
【專利說明】用于CDR移植的接受體框架
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 作為治療劑和診斷劑，單克隆抗體、它們的綴合物和衍生物在商業(yè)上極其重要。通 常在單次低劑量注射之后，非人抗體在患者中引發(fā)強烈免疫反應(yīng)（Schroff，1985Cancer Res45:879-85 ；Shawler.JImmunol1985 135:1530-5 ；Dillman,CancerBiother1994 9:17-28)。因此，開發(fā)了用于降低鼠類和其它嚙齒動物抗體的免疫原性的若干方法以及用 以使用例如轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體展示來制備完全人抗體的技術(shù)。嵌合抗體是工程化抗體， 其組合嚙齒動物可變區(qū)與人恒定區(qū)（例如BoulianneNature1984 312:643-6)，使免疫原 性問題顯著減少（例如LoBuglio，ProcNatlAcadSci1989 86:4220-4 ;Clark,Immunol Today2000 21:397-402)。人源化抗體也是工程化抗體，其中嚙齒動物可變區(qū)序列自身被 工程化來盡可能接近人序列，同時保留至少原始CDR，或其中將來自嚙齒動物抗體的CDR移 植到人抗體的框架中（例如Riechmann,Nature1988 332:323-7 ;US5, 693, 761)。兔多克 隆抗體廣泛用于生物測定，如ELISA或蛋白質(zhì)印跡。多克隆兔抗體時常由于它們的親和力 通常高得多而比多克隆嚙齒動物抗體更有利。此外，兔時常能夠引發(fā)針對在小鼠中免疫原 性不良和/或當用于噬菌體展示時不產(chǎn)生良好結(jié)合劑的抗原的良好抗體反應(yīng)。由于兔抗體 具有這些熟知優(yōu)勢，它們將理想地用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)治療性抗體。通常不進行此舉的原因主 要是由于產(chǎn)生單克隆兔抗體的技術(shù)挑戰(zhàn)。因為骨髓瘤樣腫瘤在兔中是未知的，所以用以產(chǎn) 生單克隆抗體的常規(guī)雜交瘤技術(shù)不可用于兔抗體。提供兔抗體表達細胞的融合細胞系伴侶 的開拓性工作已由Knight和同事進行（Spieker-Polet等，PNAS1995, 92:9348-52)，并且 一種改進融合伴侶細胞系已由Pytela等在2005年描述（參見例如美國專利號7429487)。 然而，這個技術(shù)并未廣泛推廣，因為相應(yīng)訣竅基本上由單一研宄組控制。涉及通過RT-PCR 自所選抗體表達細胞克隆抗體的用于產(chǎn)生單克隆抗體的替代性方法描述于文獻中，但從未 對兔抗體進行成功報道。
[0003] 類似小鼠抗體，預(yù)期兔抗體如果用于人療法，那么會引發(fā)強烈免疫反應(yīng)，因此，兔 抗體在它們可臨床使用之前需要被人源化。然而，歸因于兔與小鼠之間，并且相應(yīng)地，兔抗 體與人抗體之間的結(jié)構(gòu)差異，用于制備人源化嚙齒動物抗體的方法并不能容易地外推用于 兔抗體。舉例來說，輕鏈CDR3(CDRL3)常比先前已知的來自人或小鼠抗體的CDRL3長得多。 [0004] 存在少許描述于先前技術(shù)中的兔抗體人源化方法，然而，其不是其中非人供體 的⑶R被移植在人接受體抗體上的經(jīng)典移植方法。W0 04/016740描述一種所謂"表面重 塑"策略。"表面重塑"策略的目標在于重新塑造非人框架的溶劑可及殘基以使它們變得 更類人。如W0 04/016740中所述的用于兔抗體的類似人源化技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。 W008/144757與W005/016950兩者均公開用于使兔單克隆抗體人源化的方法，其涉及比較 親本兔抗體的氨基酸序列與類似人抗體的氨基酸序列。隨后，改變親本兔抗體的氨基酸序 列以使它的框架區(qū)在序列方面更類似于類似人抗體的等效框架區(qū)。為獲得良好結(jié)合能力， 需要個別地針對各免疫結(jié)合劑進行費力開發(fā)嘗試。
[0005] 上述方法的一個潛在問題是不使用人框架而是使兔框架工程化以使它看起來更 類人。所述方法攜有包埋在蛋白質(zhì)的核心中的氨基酸鏈段仍然可能包含免疫原性T細胞表 位的風(fēng)險。
[0006] 迄今為止，申請人尚未鑒定通過應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)移植方法加以人源化的兔抗 體。這可能用兔CDR可十分不同于人或嚙齒動物CDR的事實來解釋。如本領(lǐng)域中所知，許 多兔VH鏈相對于鼠類和人對應(yīng)物具有額外成對半胱氨酸。除在cys22與cys92之間形成 的保守二硫橋之外，也存在cyS21-cyS79橋，以及在一些兔鏈中在⑶RH1的末個殘基與⑶R H2的首個殘基之間形成的⑶R間S-S橋。此外，多對半胱氨酸殘基常見于⑶R-L3中。此 外，許多兔抗體CDR不屬于任何先前已知的典型結(jié)構(gòu)。具體來說，CDR-L3常比人或鼠類對 應(yīng)物的⑶R-L3長得多。
[0007] 因此，將非人⑶R抗體移植到人框架中是主要蛋白質(zhì)工程任務(wù)。必須在使天然環(huán) 構(gòu)象得以保留以達成抗原結(jié)合下進行將抗原結(jié)合環(huán)自天然進化的框架轉(zhuǎn)移至不同人工選 擇的人框架。常常在環(huán)移植之后，抗原結(jié)合親和力被極大降低或消除。在移植抗原結(jié)合環(huán) 時使用謹慎選擇的人框架會使人源化分子中保留結(jié)合親和力的可能性最大（Roguzka等 1996)。盡管可在文獻中獲得的許多移植實驗提供用于CDR移植的大致指導(dǎo)，但不可能概括 某一樣式。典型問題在于在移植⑶R環(huán)之后損失特異性、穩(wěn)定性或可產(chǎn)生性。
[0008] 因此，對用于可靠并快速使兔抗體人源化以用作治療劑和診斷劑的改進方法存在 緊急需要。此外，對用于可靠使兔抗體人源化，從而提供具有藥物樣生物物理學(xué)性質(zhì)的功能 性抗體和/或抗體片段的人接受體框架存在需要。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 已驚人地發(fā)現(xiàn)通過質(zhì)量控制（QC)測定（如W0 0148017中以及AufderMaur等 (2001)，F(xiàn)EBSLett508,第407-412頁中所公開）鑒定的高度可溶性和穩(wěn)定人抗體框架特 別適于接納來自其它非人動物物種的CDR，例如兔CDR。因此，在第一方面，本發(fā)明提供特定 人抗體的重鏈可變區(qū)（所謂"a58"VH框架序列），其尤其適合作為來自具有不同結(jié)合特異 性的多種抗體，特別是來自兔抗體的CDR的接受體，而與二硫橋是否存在于CDR中無關(guān)。
[0011] 通過將兔CDR移植到這個可高度相容的可變鏈框架中產(chǎn)生的人源化免疫結(jié)合劑 始終并可靠保留供體CDR所源于的兔抗體的空間取向。因此，供體免疫結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)相關(guān) 位置無需被引入接受體框架中。歸因于這些優(yōu)勢，可達成在不優(yōu)化或少許優(yōu)化結(jié)合能力下 對兔抗體的高通量人源化。
[0012] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供用于將兔和其它非人CDR移植到本文公開的可溶 性和穩(wěn)定輕鏈和/或重鏈人抗體框架序列中，由此產(chǎn)生具有優(yōu)越生物物理學(xué)性質(zhì)的人源化 抗體的方法。具體來說，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑展現(xiàn)優(yōu)越功能性質(zhì)，如可溶性和 穩(wěn)定性。
[0013] 附圖簡述
[0014]圖1描繪在本文中用于將抗原結(jié)合位點自兔單克隆抗體移植到高度可溶性和穩(wěn) 定人抗體框架中的CDRH1定義。
[0015] 圖2 :對自Kabat數(shù)據(jù)庫提取的兔抗體序列的分析確認可變重鏈的⑶R3通常比它 的鼠類對應(yīng)物長3個氨基酸。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 定義
[0018] 為使本發(fā)明可更易于理解，將如下定義某些術(shù)語。其它定義在整篇詳述中闡述。
[0019] 術(shù)語"抗體"是指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段。術(shù)語"抗原結(jié)合多肽"和"免疫 結(jié)合劑"在本文中同時使用。"抗體"是指任選糖基化的包含通過二硫鍵相互連接的至少兩 個重（H)鏈和兩個輕（L)鏈的蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合部分。各重鏈包含重鏈可變區(qū)（在本文 中縮寫為％)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域，即CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含 輕鏈可變區(qū)（在本文中縮寫為')和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域CL。VH區(qū)和 '區(qū)可進一步再分成稱為互補決定區(qū)（CDR)的具有高變性的區(qū)域，其間散布有稱為框架區(qū) (FR)的更保守區(qū)域。各主要由自氨基末端至羧基末端按以下順序排列的三個⑶R 和四個？1?組成疋1?1、0)1?1、？1?2、0)1?2、？1?3、0)1?3、？1?4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相 互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合宿主組織或因子，包括免疫系 統(tǒng)的各種細胞（例如效應(yīng)細胞）和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分（Clq)。
[0020] 術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡稱為"抗體部分"）是指一個或多個保留特異 性結(jié)合抗原（例如TNF)的能力的抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的 片段來執(zhí)行。涵蓋在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)的結(jié)合片段的實例包括（i)Fab片段， 即由\、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，即包含兩個由鉸鏈區(qū)處的 二硫橋連接的Fab片段的二價片段；（iii)由V#PCH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體 的單臂的八和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（v)單結(jié)構(gòu)域或dAb片段（Ward等，（1989)Nature 341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；以及（vi)分離的互補決定區(qū)（CDR)或（vii)兩個或更 多個可任選由合成接頭接合的分離的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域'和Vh 是由單獨基因編碼，但它們可使用重組方法由使得它們能夠制備成其中'區(qū)和VHg成對以 形成單價分子（稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等（1988)Science242:423-426;以及 Huston等（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)的單一蛋白質(zhì)鏈的合成接頭加 以接合。所述單鏈抗體也意圖涵蓋在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這些抗體片段是使 用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且篩選以與完整抗體相同的方式發(fā)揮效用的 片段?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)，或通過酶促或化學(xué)裂解完整免疫球蛋白來產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。 抗體可具有不同同種型，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型）、IgAl、IgA2、IgD、 IgE或IgM抗體。
[0021] 術(shù)語"免疫結(jié)合劑"是指含有抗體的全部或一部分抗原結(jié)合位點，例如全部或部 分重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，以使免疫結(jié)合劑特異性識別靶標抗原的分子。免疫結(jié)合劑 的非限制性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv、以及抗體片段，包括但不限于（i)Fab片 段，即由VH、（^和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，即包含兩個由鉸鏈區(qū) 處的二硫橋連接的Fab片段的二價片段；（iii)Fab'片段，其基本上是具有一部分鉸鏈區(qū)的 Fab(參見FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul編，第 3 版 1993)); (iv)由 ％和CH1 結(jié)構(gòu)域組 成的Fd片段；(v)由抗體的單臂的'和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體，如由 VH或八結(jié)構(gòu)域組成的Dab片段（Ward等，（1989)Nature341:544-546)、駱駝科抗體（參見 Hamers-Casterman,等，Nature363:446-448(1993);以及Dumoulin,等，ProteinScience 11:500-515(2002))或鯊魚抗體（例如鯊魚Ig-NARNanobodies? );以及（vii)納米抗 體，即含有單一可變結(jié)構(gòu)域和兩個恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。
[0022] 術(shù)語"單鏈抗體"、"單鏈Fv"或"scFv"是指包含由接頭連接的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu) 域（或區(qū)域；VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（或區(qū)域；')的分子。所述scFv分子可具有一般 性結(jié)構(gòu)：NH2-Vf接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭-VfCOOH。適合現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)接頭由重復(fù)GGGGS氨基酸序列或其變體組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用具有SEQIDN0:8中闡 述的氨基酸序列的（GGGGS)4接頭，但具有