一種牙鲆原始生殖細胞早期追蹤、定位方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及胚胎期PGCs的定位標記方法，具體的說是一種牙鲆原始生殖細胞早期追蹤、定位方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牙鲆是我國經(jīng)濟價值很高的海水養(yǎng)殖魚類，其肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，深受消費者歡迎。牙鲆具有雌魚比雄魚生長快，個體大的特點。近年來，隨著牙鲆雌核發(fā)育技術(shù)的突破，遺傳雌性幼魚，在關(guān)鍵發(fā)育期進行外源或者環(huán)境因子處理，可誘導(dǎo)獲得雌性或者雄性主導(dǎo)群體，牙鲆已逐步在性分化研宄領(lǐng)域成為經(jīng)濟魚類模式物種。胚胎整體原位雜交可以跟蹤胚胎發(fā)育過程中PGCs的迀移及數(shù)量變化，但這一技術(shù)主要在淡水魚中易去卵膜的魚中應(yīng)用，傳統(tǒng)的胚胎整體原位雜交前取樣及保存方式并不適用于海水魚胚胎樣品，同時步驟繁瑣。因此，建立牙鲆胚胎發(fā)育過程中PGCs的定位標記方法，對于牙鲆PGCs發(fā)生模式和分化相關(guān)規(guī)律的闡明具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種牙鲆原始生殖細胞早期追蹤、定位方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0005]一種牙鲆原始生殖細胞早期追蹤、定位方法:
[0006]I)將收集的牙鲆各階段胚胎樣品經(jīng)濃度為4% PFA溶液固定；固定后用含50%去離子甲酰胺的PBS溶液于_20°C保存，待用；
[0007]2)將上述固定后保存樣品去卵膜后進行梯度甲醇脫水、復(fù)水，待用；
[0008]3)上述復(fù)水后各個階段胚胎樣品經(jīng)用無RNA酶的PBS緩沖液洗滌，62-65°C預(yù)雜交2-4h ;雜交后將含有牙鲆RNA探針的雜交液加入至各個階段預(yù)雜交后的胚胎樣中于62-65°C下雜交過夜；雜交處理后洗滌，并經(jīng)抗體孵育，再洗滌，避光顯色，進而實現(xiàn)對牙鲆原始生殖細胞早期追蹤、定位的標記。
[0009]所述各階段胚胎樣品是將各個階段胚胎分別用無RNA酶的PBS緩沖液多次洗滌，每次5-10min ;洗滌后利用濃度4% PFA溶液于0_4°C固定24_48h。
[0010]將固定后用含50%去離子甲酰胺的PBS溶液保存的樣品去掉卵黃卵膜，而后加入至含50%去離子甲酰胺的PBS溶液中進而保存1-2月；
[0011]或，去除卵黃卵膜后用無RNA酶的PBS緩沖液洗滌多次，每次5_10min ;洗滌后25%-100% (V/V)梯度的甲醇對其進行脫水處理，每個梯度5-10min脫水處理，脫水后再用100% — 25%梯度的甲醇進行復(fù)水處理，每個梯度5-10min。
[0012]所述含有牙鲆RNA探針的雜交液是將用預(yù)雜交液稀釋探針至終濃度為l_2ng/ul，再將其置于75-85?變性10-15min，變性后加入至各個階段預(yù)雜交后的胚胎樣中；所述探針為:
[0013]DF:5’ -GTTCTGCGTGTGCTGACT-3’ ；
[0014]DR: 5 ’ -TTGTCTTGGAACAGGGCT-3’。
[0015]所述預(yù)雜交液為:50(v) %去離子甲酰胺，25 (V) % 20 X SSC, 50mg/ml肝素50 μ 1，酵母 tRNA 25mg, 0.1 (v) % Tween 20，0.5M 的朽1 檬酸(Citric Acid) 850 μ I，加無 RNAase 超純水到50ml，最終PH為6.0-6.5。
[0016]所述雜交處理后洗滌是將雜交后各階段樣品分別用進行系列洗脫；系列洗脫是首先在62-65°C下用體積比為1:1的去離子甲酰胺和2XSSCT混合液洗滌多次，每次30min，再在62-65°C下用2XSSCT洗滌多次，每次15min，而后62_65°C下用0.2XSSCT洗滌多次，每次30min，最后在室溫下用無RNA酶的PBS緩沖液洗滌多次，每次5min。
[0017]所述雜交處理洗滌后向各階段樣品中加入濃度為1-2% blocking室溫下封閉處理2-4h，而后再加入堿性磷酸酶抗體在室溫下經(jīng)抗體孵育2-4h，再避光顯色處理，進而定位標記。
[0018]所述經(jīng)抗體孵育后的各階段樣品用無RNA酶的PBS緩沖液洗滌多次，每次1min ；洗滌之后加入BCIP/NBT顯色液在4°C過夜或室溫下2-4h避光顯色處理，進而定位標記。
[0019]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0020]1.牙鲆屬于分批產(chǎn)卵的海水魚類，取樣通常在養(yǎng)殖場完成，無法進行隨時取樣，同時取樣后也無法即刻完成后續(xù)的定位操作。海水魚相較模式生物斑馬魚卵膜與胚盤間隙要小很多，剝除卵膜和卵黃困難，傳統(tǒng)的保存方法不適用于本物種。本發(fā)明物種提供了一種可以取樣后長期保存的方法。同時，經(jīng)50%去離子甲酰胺保存后的胚胎樣品比直接在固定液中保存的樣品，更干凈透亮，便于后續(xù)的操作。
[0021]2.牙鲆卵較軟，固定及長期保存中均去掉Tween，直接用濃度為4% PFA固定，用含50%去離子甲酰胺的PBS長期保存。
[0022]3.傳統(tǒng)原位雜交中抗體孵育后用MT洗滌，本發(fā)明中經(jīng)抗體孵育后，用PBST替代MAT，可以減慢顯色速度，信號檢測效果很好，同時背景色較淺，適合于胚胎整體原位雜交。
[0023]4.本發(fā)明提出胚胎整體原位雜交后，雜交探針可以回收再利用，大大節(jié)約實驗成本。
[0024]5.本發(fā)明提供了更加便利實用的樣品保存方法，解決了傳統(tǒng)胚胎整體原位雜交經(jīng)甲醇脫水保存后導(dǎo)致去卵膜卵黃困難的問題，顯色過程用PBST替換MT簡化了操作步驟。本發(fā)明能很好地對牙鲆胚胎發(fā)育過程中的PGCs進行定位標記
【附圖說明】
[0025]圖1牙鲆早期胚胎發(fā)育原始生殖細胞的起源，迀移和增殖過程。
【具體實施方式】
[0026]實施例
[0027]1.取樣，洗樣。根據(jù)胚胎發(fā)育時序，在體視鏡下跟蹤受精卵的發(fā)育狀態(tài)，采集各關(guān)鍵期樣品0.5ml，用無RNA酶的PBS緩沖液，洗滌兩次，洗去海水，每次l_2min。
[0028]2.固定。洗滌以后的胚胎樣品置于15ml無RNAase離心管中，樣品與濃度為4%PFA的體積比為1:10，顛倒混勻以后，平放置于4°C，固定24h。
[0029]3.長期保存。用含50%去離子甲酰胺緩沖液(含50%去離子甲酰胺緩沖液是由體積比為1:1的去離子甲酰胺:無RNA酶的PBS緩沖液混合)置換4% PFA,置于_20°C長期保存。
[0030]4.剖卵。在體式鏡下，在胚胎樣品中加入含50%去離子甲酰胺緩沖液使樣品潤濕，剖除卵膜和卵黃。
[0031]5.洗滌。剖除卵膜和卵黃后采用無RNA酶的PBS緩沖液，洗滌，5minX 3。
[0032]6.脫水。洗滌后采用梯度甲醇(甲醇(PBST) 25%、50%、75%、100% )脫水，每個梯度5min。
[0033]7.洗滌。脫水處理后再經(jīng)用無RNA酶的PBS緩沖液，洗滌，5minX 3。8.復(fù)水。洗滌后再經(jīng)梯度甲醇(甲醇(PBST) 100%、75%、50%、25% )復(fù)水，每個梯度5min。
[0034]9.預(yù)雜交。復(fù)水后加入至1.5ml無RNAase離心管中，再加入Iml預(yù)雜交液，封口膜封好，置于65°C烘箱，預(yù)雜交2h。