一種腺病毒實(shí)時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈反應(yīng)） 試劑盒，尤其涉及一種腺病毒實(shí)時熒光定量PCR試劑盒。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]腺病毒（Adenovirus，ADV)是導(dǎo)致免疫抑制個體發(fā)病率和死亡率的主要誘因。腺 病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，腺病毒對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、眼、肝臟等均可 感染，人腺病毒約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關(guān)，但一種血清型可引起不同的臨 床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。此前病毒分離與鑒定的方法主要為：病毒 的分離培養(yǎng)，標(biāo)本應(yīng)盡早從感染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，糞便和尿液等，加抗 生素處理過夜，離心取上清接種敏感細(xì)胞（293、Ifep-2或HeLa細(xì)胞等)，37°C孵育后可觀察 到典型CPE，即細(xì)胞變圓、團(tuán)聚、有拉絲現(xiàn)象，最突出的表現(xiàn)是許多病變細(xì)胞聚在一起呈葡萄 串狀。病毒抗原抗體鑒定，用熒光標(biāo)記的抗六鄰體抗體與分離培養(yǎng)細(xì)胞作用來鑒定腺病毒， 也可用血凝抑制（hemoagglutinationinhibition，HI)試驗或中和試驗（neutralization test，NT)檢測屬和組特異性抗原并鑒定病毒的血清型。
[0005] 上述所述檢測病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它們也有不足的地方，如 病毒的分離培養(yǎng)，是需要耗費(fèi)大量人力、物力和時間的，抗體檢測對一些臨床樣本缺乏足夠 的靈敏度，有時不能判定出一些正常個體中的潛伏感染。一種更有效快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)， 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對ADV進(jìn)行檢測，取病變組織或細(xì)胞，提取病毒DNA，與標(biāo)記的病毒 DNA探針和引物進(jìn)行雜交來判斷是否被感染。這種方法的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在高靈敏度、高準(zhǔn)確性和 高速率，在應(yīng)對病毒大爆發(fā)流行時能為醫(yī)院等單位在面臨大堆的臨床樣本時提供更加快速 精確的檢測，及時對疫情的加以控制和對流行病學(xué)調(diào)查作出巨大的貢獻(xiàn)。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種腺病毒實(shí)時熒光 定量PCR試劑盒。
[0008]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的： 1、腺病毒實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(簡稱試劑盒） 本試劑盒是在對腺病毒核酸序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計出一對特異性 引物和一條特異性的熒光探針，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對腺病毒進(jìn)行檢測。此技術(shù)不 僅縮短了操作時間，減少了污染，也降低了樣品診斷的成本，具有潛在的應(yīng)用價值。
[0009]在按下述方法設(shè)計的引物和探針存在下，在熒光定量PCR儀中，對病毒核酸進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，來實(shí)現(xiàn)對腺病毒的檢測。
[0010] 具體地說，本試劑盒包括腺病毒的一對特異性引物（F和R)、一條特異性熒光探針 (FP)、陽性對照、陰性對照、5XPCRBuffer和EnzymeMix; ① 特異性引物 F:5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3' 25bp, R:5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3' 27bp； ② 熒光探針 FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2 30bp， 熒光探針5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)Cy5,3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ-2 ; ③ 陽性對照 腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品； ④ 陰性對照 RNaseFreeH20 ； ⑤ 5XPCRBuffer配制 Tris ?Cl 20mM KC1 80mM (NH4)2S04 80mM DTT 1. 5mM MgCl2 12mM dNTP lOmM 配置混合后于冰箱_20°C保存； ⑥EnzymeMix配制 Tris ?Cl 20mM KC1 80mM DTT ImM EDTA 0.ImM NonidetP-40 0. 5% Tween20 0.5% 甘油 50% Taq酶 2.5U/ul 配置混合后于冰箱_20°C保存。
[0011] 2、試劑盒的使用方法 ①病毒核酸的提?。?A、 首先在緩沖液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇； 在漂洗液中加入30μg/mlcarrierRNA; B、 取30y1蛋白酶放入1. 5ml離心管中； C、 將標(biāo)本(如咽拭子等）取200y1加入此管中，充分混勻； D、 再在每管分別加入200y1漂洗液(含30yg/mlcarrierRNA)，混勻振蕩30s，70°C 溫育lOmin; E、 加入250y1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min; F、 將上述裂解液加入離心柱中，8000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍放回 收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液； G、 濾柱中加入500y1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液； H、 另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入 500y1緩沖液2,12000rpm，離心lmin，重復(fù)步驟⑧一次； I、 將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm，離心3min，后將濾柱放在37°C15min 以干燥濾膜； J、 將濾柱放在1. 5mlEppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_freeH20,室溫靜置 2min。12OOOrpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。
[0012] ②實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增(每份25ul體系） 取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中進(jìn)行熒 光定量PCR擴(kuò)增。
[0013]A、實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)液(mix)的配制： 5xPCR buffer 8ul Enzyme Mix 5ul 特異性引物F和R 各lul 特異性熒光探針FP 2ul Rnase Free H20 3ul 反應(yīng)液體積： 20ul B、一步實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)程序： X: 95°C 2min Z 95°c15s # 64°C 30s 60°Clmin ：FGoto% ,45cycles 步驟f從64°C開始開始熒光檢測。
[0014] c、檢測儀器： 本發(fā)明使用LightCycle 480II熒光定量PCR儀，在FAM通道進(jìn)行檢測。
[0015] D、結(jié)果判斷： 在熒光定量PCR儀運(yùn)轉(zhuǎn)正常，陰性對照和陽性對照均正常的情況下， (1) 當(dāng)Ct< 35時，判斷樣品為腺病毒陽性； (2) 當(dāng)35〈Ct< 40時，重復(fù)一次實(shí)驗，如果Ct還是在此范圍之內(nèi)或小于 35就判斷樣品為腺病毒陽性，否則判斷樣品為腺病毒陰性。
[0016] (3)當(dāng)Ct>40時，判斷樣品為腺病毒陰性。
[0017] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果： ① 檢測時間周期短、檢測效率高； ② 檢測病毒特異性高，準(zhǔn)確率高； ③ 在進(jìn)行病毒定性分析的同時還能進(jìn)行病毒定量分析； ④ 檢測靈敏度比普通PCR和免疫學(xué)檢測方法靈敏度高； ⑤ 操作簡單、易于推廣； ⑥ 實(shí)驗結(jié)果重復(fù)性好。
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【附圖說明】
[0019] 圖1是30份ADV陽性標(biāo)本熒光定量PCR擴(kuò)增曲線； 圖2是18份ADV陽性標(biāo)本熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施