一種利用hu蛋白有效提高rca擴(kuò)增效率的方法
【專利說明】一種利用HU蛋白有效提高RCA擴(kuò)増效率的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的一種HU蛋白的應(yīng)用，具體涉及一種利用HU蛋白有效 提高RCA擴(kuò)增效率的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 為了取代PCR技術(shù)或彌補(bǔ)它的不足，近十幾年來發(fā)展起來了一些新的核酸擴(kuò)增技 術(shù)，其中滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA)因其簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)受到極大的 重視。RCA是一種基于連接酶連接、引物延伸、與鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該 方法不僅可以擴(kuò)增環(huán)狀DNA、RNA，也可以實(shí)現(xiàn)全基因組DNA的擴(kuò)增，目前在SNPs的檢測(cè)、蛋 白質(zhì)芯片的檢測(cè)、核酸的測(cè)序等方面有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 在自然界中，諸如質(zhì)?；虿《镜拳h(huán)型DNA分子的復(fù)制，通常都是通過滾環(huán)擴(kuò)增的 機(jī)理實(shí)現(xiàn)的。在滾環(huán)擴(kuò)增的過程中，在dNTPs存在的條件下，將隨機(jī)引物退火至環(huán)狀DNA模 板的多個(gè)位點(diǎn)，然后在phi29DNA聚合酶的作用下產(chǎn)生多個(gè)復(fù)制叉，使得環(huán)狀DNA模板循環(huán) 擴(kuò)增，形成由上千個(gè)反復(fù)銜接的環(huán)型DNA鏈的拷貝構(gòu)成的DNA聯(lián)聚分子，從而提高合成速度 和產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)模板的指數(shù)擴(kuò)增。這種方法可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，因而在核酸檢測(cè)中具有 極大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。
[0004] 盡管RCA技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)愈加廣泛，該技術(shù)依然存在一些亟待解決的問題。其中 最顯著的就是反應(yīng)過程中產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的問題，實(shí)際上，即使是在最佳的反應(yīng)條件下， 如對(duì)隨機(jī)引物進(jìn)行優(yōu)化，也不能徹底消除該反應(yīng)過程中產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，尤其是 在使用的DNA模板復(fù)雜或者含量低的情況下。這些非特異性擴(kuò)增多是由于在反應(yīng)過程中一 些位點(diǎn)形成引物二聚體導(dǎo)致錯(cuò)配而產(chǎn)生的，。其次就是靈敏度的問題，雖然使用較高濃度的 高反應(yīng)活性連接酶也有利于提高靈敏度，但同時(shí)也會(huì)使非特異性成環(huán)的概率增加。所以，如 何做到高靈敏度和高特異性是RCA技術(shù)極具挑戰(zhàn)性的問題。
[0005] 單鏈 DNA 結(jié)合蛋白（single-strand DNA blinding protein，SSB)是一類結(jié)合在 單鏈DNA上的蛋白。細(xì)胞的所有的生命形式及大部分病毒都需要此類蛋白，其在DNA進(jìn)行 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)等生理過程中起著重要作用。在dsDNA(雙鏈DNA)解旋時(shí)SSB蛋白結(jié)合 在ssDNA(單鏈DNA)上，使其保持穩(wěn)定，以防ssDNA重新配對(duì)成雙鏈或被核酸酶降解，從而 對(duì)ssDNA起到相應(yīng)的保護(hù)作用；除了對(duì)ssDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用之外，SSB還能促進(jìn)同源的核 苷酸鏈進(jìn)行配對(duì)。SSB蛋白只結(jié)合單鏈DNA，但不結(jié)合雙鏈DNA，通過結(jié)合并抑制含有單鏈的 非特異性片段的擴(kuò)增。
[0006] 使用隨機(jī)六聚體和噬菌體phi29DNA聚合酶來對(duì)質(zhì)?；蚧蚪MDNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA)，這種方法已經(jīng)越來越多的被用于DNA測(cè)序中的模板擴(kuò)增中。Mikawa T等人已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)，源于嗜熱菌HB8的單鏈結(jié)合蛋白SSB的突變體蛋白TthSSB可以在RCA反應(yīng)過程中提高 模板擴(kuò)增的效率。此外，TthSSB突變體蛋白增強(qiáng)phi29DNA聚合酶的特異性。他們將分別 將天然的和發(fā)生突變的TthSSB在大腸桿菌中進(jìn)行了過度表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行了純化至同質(zhì)； 發(fā)現(xiàn)在體外，這些蛋白質(zhì)可特異性與單鏈DNA結(jié)合。在RCA反應(yīng)過程中，通過與單鏈DNA結(jié) 合，TthSSB突變蛋白可以明顯地縮短phi29DNA聚合酶合成一段DNA片段時(shí)所需的延伸時(shí) 間。此外，TthSSB突變體蛋白基本上消除了在RCA反應(yīng)過程中產(chǎn)生的非特異性的DNA產(chǎn)物。
[0007] 與真核染色質(zhì)類似，細(xì)菌染色體也需同多種蛋白結(jié)合，才能被有效高度壓縮，并有 序排列。而來源于大腸桿菌菌株U93的組蛋白樣蛋白（HU)，作為一種與DNA非特異性結(jié)合的 蛋白，在細(xì)菌染色體的壓縮和排列過程中扮演了重要角色。它除了維持DNA的超螺旋和壓 縮狀態(tài)外，還能對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)起到一些特殊的作用，如DNA的彎曲、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、起始于復(fù) 制原點(diǎn)的復(fù)制、核蛋白復(fù)合物在裝配時(shí)所需的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，以及通過蛋白質(zhì)-RNA 相互作用控制的翻譯起始等。HU是由兩個(gè)同源亞基HupA和HupB組成，是最保守的核酸結(jié) 合蛋白，可非特異性結(jié)合雙鏈DNA，也有發(fā)現(xiàn)其對(duì)于缺口和彎曲的DNA有特定偏好。HU蛋白 不但能像結(jié)合單鏈DNA的SSB蛋白一樣與單鏈DNA結(jié)合，同時(shí)還能結(jié)合雙鏈的DNA。目前從 尚未見有HU蛋白對(duì)RCA擴(kuò)增影響的相關(guān)報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供了一種。
[0009] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種利用特異性DNA結(jié)合蛋白HU蛋白同時(shí)提高滾環(huán)擴(kuò)增靈 敏度和特異性的方法包括以下步驟：
[0010] ⑴使用TempliPhiTMDNA測(cè)序模板擴(kuò)增試劑盒：
[0011] A.變性：以環(huán)狀DNA作為模板，在5 y 1樣品緩沖液中加入lng環(huán)狀DNA，混勻后， 95°C加熱3min，然后冷卻至室溫或4°C，獲得變性樣品液，待用；
[0012] B.培育：在5 y 1反應(yīng)緩沖液中加入0. 2 y 1試劑盒中提供的Phi29DNA聚合酶，混 勻，置于冰上，得到預(yù)混合酶液；將5 y 1預(yù)混合酶液加入所述變性樣品液中，混勻，得到RCA 反應(yīng)液；在各RCA反應(yīng)液中分別加入濃度為4. 0±0. 4ng/ y 1的HU蛋白0. 1 y 1-10 y 1 ;各 RCA反應(yīng)液分別于30°C下水浴4-18h ;65°C加熱lOmin，冷卻至4°C ;分別3 y 1 RCA產(chǎn)物以 1%瓊脂糖凝膠取3 y 1反應(yīng)混合液于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟B中，HU蛋白是直接一次性加入至反應(yīng)體系所需組分中。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過在RCA反應(yīng)過程中分別加入濃度為4. 0±0. 4ng/ y 1的 HU蛋白0. 1 y 1-10 y 1，可以顯著地提高滾環(huán)擴(kuò)增的效率，同時(shí)明顯增強(qiáng)滾環(huán)擴(kuò)增的靈敏度 和特異性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)市售RCA試劑盒的進(jìn)一步優(yōu)化。 【【附圖說明】】
[0015] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0016] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中的S-PAGE電泳檢測(cè)圖。
[0017] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中HU蛋白的活性檢測(cè)圖。
[0018] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中濃度為4. 4ng/ul的HU蛋白對(duì)RCA擴(kuò)增效率的影響結(jié)果 圖。
[0019] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中濃度為4.4ng/ul HU蛋白對(duì)