一種二萜類化合物的抗腫瘤藥物及其方法用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然提取物藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種二萜類化合物的抗腫瘤 藥物及其方法用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊擲躅（Rhododendron molle G. Don)為杜花科植物，分布于我國長江流域至南 部各地，生長于山坡、灌叢或草叢中。羊躑躅的花、果實和根等均可供藥用?；ㄒ话惴Q鬧羊 花，味辛，溫，有大毒，入肝經(jīng)；具有定痛、驅(qū)風(fēng)和除濕等功效，用于風(fēng)濕頑痹，傷折疼痛，皮膚 頑癬。果實一般稱六軸子或八里麻，味苦，溫，有大毒，入肺、脾經(jīng)；具有搜風(fēng)止痛、止咳平喘 等功效，用于風(fēng)寒濕痹，跌打損傷，咳喘。根味辛，溫，有毒，入脾經(jīng)；具有祛風(fēng)、止咳、散瘀和 止痛等功效，用于風(fēng)寒濕痹，跌打損傷，痔漏，癬瘡?；瘜W(xué)研宄表明，二萜和黃酮類化合物是 羊躑躅花、果實和根等的主要成分，其中二萜類成分既是主要有效成分，也是其毒性成分。
[0003] 目前從羊躑躅的花、果實和根中分離得到并經(jīng)結(jié)構(gòu)確證的二萜類成分根據(jù)母 核主要分為兩大類：grayanane型和kalmanol型。Grayanane型代表性化合物包括： rhodomollein XVI、rhodomollein XVII、rhodomollein XVIII、rhodojaponin III、 rhodojaponin VI (Diterpenoids from the Fruits of Rhododendron molle? J. Nat. Prod. 2000,63，1214_1217) ;rhodomoside A和rhodomoside B(Diterpenoid and Phenolic Glycosides from the roots of Rhododendron molle) ；rhodomollein IX、rhodomollein X、rhodomollein XI、rhodomollein XII 和 rhodomollein XIII (Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle，J. Nat. Prod. 2004,67,1903-1906) ;rhodomolin A 和 rhodomolin B(Grayanane Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle with Cytotoxic Activity against a Spodoptera frugiperda Cell Line，J. Nat. Prod. 2005， 68,924-926) ;seco-rhodomo1lone(Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle，J. Nat. Prod. 2014, 77,1185-1192)。Kalmanol 型代表性化合物包括：rhodomollein XV、 kalmanol(Diterpenoids from the Fruits of Rhododendron molle， J.Nat. Prod. 2000,63,1214-1217)和 rhodomollein XIV(Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle，J. Nat. Prod. 2004,67,1903-1906)。代表性Grayanane 型和 kalmanol 型二萜化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0004] 鬧羊花為羊躑躅的干燥花，具有祛風(fēng)除濕、散瘀定痛之功效，可用于風(fēng)濕痹痛、偏 正頭痛、跌撲腫痛、頑癬[中華人民共和國藥典（一部）[S]，2010版]。其化學(xué)成分研究始 于二十世紀(jì)八十年代，研究內(nèi)容主要集中于其二砲類化學(xué)成分^ Grayanane型和kalmanol 型二萜類化合物主要通過液液萃取和不同類型填料的柱色譜法分離純化得到。典型的方法 為：第一步，不同濃度的醇溶液提?。坏诙?，提取物分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，分成不同極性段；第三步，取二萜類化合物集中的乙酸乙酯萃取物用正相硅 膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、MCI微孔樹脂柱色譜或者凝膠柱色譜細(xì)分純化。
[0005] 鬧羊花中二萜類成分藥理活性篩選的報道較少，細(xì)胞毒活性研究更少。2005年， Zhong等報道了鬧羊花中兩個Grayanane型化合物rhodomolins A和rhodomolins B對斜 紋夜蛾細(xì)胞系 Sf_9 的細(xì)胞毒作用，IC50 值在 12-80 y g/mL(Grayanane Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle with Cytotoxic Activity against a Spodoptera frugiperda Cell Line，J.Nat.Prod.2005,68,924_926)。目前尚未見鬧羊花中kalmanol 型二萜成分的活性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，在針對鬧羊花有效成分研宄中，從乙酸乙酯萃 取物中分離鑒定了一個新的kalmanol型二貓化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)上為rhodomollein XXIV 5 位羥基和1位氫脫水產(chǎn)物，為首次報道，命名為kalmanene。細(xì)胞毒試驗表明，該化合物對腫 瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用，對正常細(xì)胞細(xì)胞毒作用相對較弱，可以作為制備抗腫瘤藥 物的活性成分。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種二萜類化合物，其制備方法包括：
[0008] A.將鬧羊花用二氯甲烷一次或多次脫脂，過濾，收集濾渣；
[0009] B.將鬧羊花用醇或醇溶液提取一次或多次，過濾，收集濾液，再減壓濃縮干燥，獲 得醇提取物；
[0010] C.將醇提取物加水，以石油醚萃取再次脫脂后，以乙酸乙酯萃取，獲得的乙酸乙酯 萃取液再以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，獲得乙酸乙酯萃取物粗品；
[0011] D.將獲得的粗品進行柱色譜分離純化，得到純化后的二萜類化合物。
[0012] 所述步驟D的詳細(xì)步驟可以包括：
[0013] ①將粗品在硅膠上進行柱層析，用乙酸乙酯_乙醇梯度洗脫，獲得乙酸乙酯-乙醇 洗脫物；
[0014] ②取乙酸乙酯-乙醇洗脫物再進行硅膠柱層析，用二氯甲烷-甲醇等度洗脫，收集 6-8柱體積洗脫部位，濃縮；
[0015] ③取步驟②濃縮物進行反相硅膠柱層析，用水-甲醇等度洗脫，收集4-5柱體積洗 脫部位，濃縮；
[0016] ④取步驟③濃縮物用制備型高效液相色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，從水-甲醇洗 脫部位得到純的化合物I。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種二萜類化合物，所述二萜類化合物的 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
【主權(quán)項】
1. 一種二萜類化合物，其特征在于，制備方法包括： A. 將鬧羊花用二氯甲烷一次或多次脫脂，過濾，收集濾渣； B. 將鬧羊花用醇或醇溶液提取一次或多次，過濾，收集濾液，再減壓濃縮干燥，獲得醇 提取物； C. 將醇提取物加水，以石油醚萃取再次脫脂后，以乙酸乙酯萃取，獲得的乙酸乙酯萃取 液再以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，獲得乙酸乙酯萃取物粗品； D. 將獲得的粗品進行柱色譜分離純化，得到純化后的二萜類化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二萜類化合物，其特征在于，所述步驟D的詳細(xì)步驟包括： ① 將粗品在硅膠上進行柱層析，用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，獲得乙酸乙酯-乙醇洗脫 物； ② 取乙酸乙酯-乙醇洗脫物再進行硅膠柱層析，用二氯甲烷-甲醇等度洗脫，收集6-8 柱體積洗脫部位，濃縮； ③ 取步驟②濃縮物進行反相硅膠柱層析，用水-甲醇等度洗脫，收集4-5柱體積洗脫部 位，濃縮； ④ 取步驟③濃縮物用制備型高效液相色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，從水-甲醇洗脫部 位得到純的化合物I。
3. -種二萜類化合物，其特征在于，所述二萜類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
4. 一種如權(quán)利要求1~3中任一項所述二萜類化合物的藥理學(xué)活性測試方法，其特征 在于，包括如下步驟： A. 取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 y L，含1000-1200個腫瘤細(xì) 胞；次日，給藥組加入含有不同濃度化合物，每藥設(shè)4個劑量組，每組設(shè)3個平行板； B. 對照組加入與所述二萜類化合物等體積的溶劑，置5% 0)2溫箱中于37°C培養(yǎng)，4d 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 y L 0. 2% MTT溶液，37°C保溫4h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 y L溶解甲簪顆粒，輕度震蕩后，用酶標(biāo)儀，在參考波長450nm，檢測波長570nm條件下測 定光密度OD值； C. 以溶劑對照處理的細(xì)胞株為對照組，以紫杉醇作為陽性對照藥品，測量結(jié)果用以下 公式計算藥物對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的抑制率：
D. 由所得細(xì)胞抑制率使用LOGIT法計算化合物IC5tl數(shù)值。
5. -種如權(quán)利要求1~3中任一項所述二萜類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述二萜類化合物制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的 腫瘤為結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、肝癌細(xì)胞株Bcl-7402、非小細(xì)胞肺癌細(xì) 胞株A549和/或乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。
7. -種如權(quán)利要求1~3中任一項所述二萜類化合物在檢測抗腫瘤藥物的活性中的應(yīng) 用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述二萜類化合物在檢測抗腫瘤藥物活性中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的腫瘤為結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、肝癌細(xì)胞株Bcl-7402、非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞株A549和/或乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。
9. 一種如權(quán)利要求1~3中任一項所述二萜類化合物在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述二萜類化合物在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述 的腫瘤為結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、肝癌細(xì)胞株Bcl-7402、非小細(xì)胞肺癌 細(xì)胞株A549和/或乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二萜類化合物，其制備方法包括：A.將鬧羊花用二氯甲烷一次或多次脫脂，過濾，收集濾渣；B.將鬧羊花用醇或醇溶液提取一次或多次，過濾，收集濾液，再減壓濃縮干燥，獲得醇提取物；C.將醇提取物加水，以石油醚萃取再次脫脂后，以乙酸乙酯萃取，獲得的乙酸乙酯萃取液再以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，獲得乙酸乙酯萃取物粗品；D.將獲得的粗品進行柱色譜分離純化，得到純化后的二萜類化合物。本發(fā)明二萜類化合物對結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29、HCT-8)、肝癌細(xì)胞(Bcl-7402)、非小細(xì)胞肺癌(A549)和/或乳腺癌(MCF-7)具有很強的抑制作用。
【IPC分類】C07C29-76, A61P35-00, C07C35-44, G01N21-31
【公開號】CN104817432
【申請?zhí)枴緾N201510133850
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】青島華仁技術(shù)孵化器有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年3月25日