n 4691)，包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的第 250位氨基酸處從纈氨酸（Val或V)變?yōu)楣劝彼幔℅lu或E)的突變。所述V250E突變位于 ACS4蛋白的大結(jié)構(gòu)域中。SEQ ID N0:6描述了突變體4691的蛋白序列。所述氨基酸的置 換是由于SEQ ID NO: 1的第749位核苷酸的T變?yōu)锳，將起始密碼子ATG的A計數(shù)為核苷酸 位置1。SEQ ID NO: 13描述了該突變cDNA。
[0060] 本發(fā)明所鑒定的賦予降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的另 一個示例性突變acs4等位基因（突變體5251或Nun 5251)，包含導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的第 316位氨基酸從蘇氨酸（Thr或T)變?yōu)楫惲涟彼幔╨ie或I)的突變。所述T316I突變位于 ACS4蛋白的第二小結(jié)構(gòu)域中。SEQ ID N0:7描述了突變體5251的蛋白序列。所述氨基酸 的置換是由于SEQ ID NO: 1的第947位核苷酸的C變?yōu)門，將起始密碼子ATG的A計數(shù)為核 苷酸位置1。SEQ ID NO: 14描述了該突變cDNA。
[0061] 本文中的"突變等位基因"是指與野生型等位基因相比在編碼序列（mRNA、cDNA或 基因組序列）中含有一個或多個突變的等位基因。這類突變（例如，一個或多個核苷酸的 插入、倒位、缺失和/或置換）可導(dǎo)致所編碼的蛋白具有降低的體外和/或體內(nèi)功能（功能 降低）或沒有體外和/或體內(nèi)功能（功能喪失），例如，由于所述蛋白例如被截短或者具有 其中一個或多個氨基酸被缺失、插入或置換的氨基酸序列。這類改變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有不 同的3D構(gòu)象、被靶向到不同的亞細胞區(qū)室、具有經(jīng)修飾的催化結(jié)構(gòu)域、具有經(jīng)修飾的對核 酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合活性等。
[0062] 本文中的"野生型植物"和"野生型果實"或"正常成熟"的植物/果實是指含有編 碼完全功能性Acs4蛋白的野生型（WT)Acs4等位基因（Acs4/A CS4)的兩個拷貝的番茄植物 (例如不同于含有突變acs4等位基因的"突變植物")。這些植物為例如在表型測定中的合 適的對照。優(yōu)選地，野生型和/或突變植物是"栽培的番茄植物"。例如栽培種Moneymaker、 栽培種Ailsa Craig、栽培種Tapa以及許多其他栽培種都是野生型植物。
[0063] "番茄植物"或"栽培的番茄植物"是這樣的番茄的植物：即人工栽培并具有優(yōu) 良的農(nóng)藝學(xué)特征的番茄種的品種、育種系或栽培種；優(yōu)選地，這類植物不是"野生植物"， 所述野生植物即一般具有比栽培植物差得多的產(chǎn)量和差得多的農(nóng)藝特征以及例如在野生 群中天然生長的植物。"野生植物"包括例如物種的生態(tài)型、PI (植物引種）系、當(dāng)?shù)仄贩N (Iandrace)或野生登記物或野生近緣種。所謂的傳統(tǒng)品種（heirloom variety)或栽培 種一一即，通常在人類歷史的較早時期被種植并通常被改造為適于特定地理區(qū)域的自由授 粉品種或栽培種一一在本文中被作為栽培番茄植物被涵蓋在本發(fā)明的一個方面中。
[0064] 番前的野生近緣種（wild relative)包括：S. arcanum、克梅留斯基番 前（S. chmielewskii)、小花番前（S. neorickii = L. parviflorum)、契斯曼尼番前 (S. cheesmaniae)、多腺番前（S. galapagense)、細葉番前（S. pimpinellifolium)、智利 番前（S. chilense)、S. corneliomulleri、多毛番前（S. habrochaites = L. hirsutum)、 S. huaylasense、赤前（S. sisymbriifolium)、秘魯番前（S. peruvianum)、多毛番前 (S. hirsutum)或潘那利番前（S.pennellii)。
[0065] 本文中的"平均"是指算數(shù)平均值。
[0066] 序列表說明
[0067] SEQ ID NO: 1示出了從基于Genbank登錄號AAA34131. 1的mRNA獲得的番茄野生 型、完全功能性ACS4蛋白序列（由Genbank登錄號M63490. 1的cDNA編碼）。
[0068] SEQ ID NO:2示出了番茄突變體2477 acs4蛋白序列。
[0069] SEQ ID NO:3示出了番茄突變體4043 acs4蛋白序列。
[0070] SEQ ID NO:4示出了番茄突變體4222 acs4蛋白序列。
[0071] SEQ ID NO:5示出了番茄突變體4303 acs4蛋白序列。
[0072] SEQ ID N0:6示出了番茄突變體4691 acs4蛋白序列。
[0073] SEQ ID N0:7示出了番茄突變體5251 acs4蛋白序列。
[0074] SEQ ID N0:8 示出 了基于 Genbank 登錄號 M63490. 1 的番茄野生型 Acs4 cDNA。
[0075] SEQ ID N0:9 示出了番茄突變體 2477 acs4 cDNA。
[0076] SEQIDN0:10示出了番茄突變體 4043 acs4cDNA。
[0077] SEQ ID N0:11 示出了番茄突變體 4222 acs4 cDNA。
[0078] SEQIDN0:12示出了番茄突變體 4303 acs4cDNA。
[0079] SEQIDN0:13示出了番茄突變體 4691 acs4cDNA。
[0080] SEQIDN0:14示出了番茄突變體 5251 acs4cDNA。
[0081] SEQ ID勵：15示出了番茄野生型八〇84基因組0嫩。
【附圖說明】
[0082] 圖 I :本圖不出了 Capitani 等人（Journal of Molecular Biology, 1999, vol 194, pp 745-756)的圖I中給出的5個序列的氨基酸序列（甜瓜、天竺葵、甘藍、綠豆和馬鈴 薯）與SEQ ID NO 1中給出的野生型番茄ACS4氨基酸序列的比對。
[0083] 圖2 :在粉紅期和紅熟期以nV(h · g)(也寫作nl · IT1 · f1)測量的番茄果實的乙 稀釋放。Tapa是商業(yè)野生型栽培種（Acs4/Acs4)。
[0084] 圖3 :本圖示出了處于紅熟期的果實的百分比，其是在野生型對照果實開始進入 破色期[在第一天，野生型的第一顆果實處于破色期]后的不同天數(shù)時確定的。與野生型 (wt)相比，本發(fā)明的突變植物的所有果實都需要更多天才能成熟，"Ho"是指特定acs4突變 純合型（acs4/a CS4)的突變植物（前面的編號所指示的）的果實；He是指特定acs4突變 雜合型（Acs4/aCS4)的突變體（前面的編號所指示的）的果實。
[0085] 圖4 :SEQ ID NO: 1-7的比對。還描述了 Acs4的結(jié)構(gòu)域（淺灰色）及突變（加粗 并加下劃線）。
【具體實施方式】
[0086] 本發(fā)明公開了包含具有一個或多個突變的acs4等位基因的番茄種的栽培植物， 所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Acs4蛋白相比功能喪失和/或功能降低的突變acs4蛋白。 [0087] 所述Acs4蛋白序列含有3個結(jié)構(gòu)域："大結(jié)構(gòu)域"，是指本申請的圖4所示的第65 至327位氨基酸殘基；以及兩個小結(jié)構(gòu)域，分別指本申請的圖4所示的第33至62及339至 438位氨基酸殘基。Acs4催化中心被認(rèn)為位于"大結(jié)構(gòu)域"中。
[0088] 在一方面，本發(fā)明涉及包含具有一個或多個突變的acs4等位基因的番茄種的栽 培植物和/或其部分（例如果實），所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Acs4蛋白相比功能喪失或 功能降低的突變acs4蛋白，其中與野生型完全功能性Acs4等位基因（編碼SEQ ID N0:1 的功能性Acs4蛋白或功能性變體）純合型（Acs4/Acs4)的番前植物相比，所述一個或多個 突變導(dǎo)致降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的果實成熟和/或更長的貯藏期。
[0089] 編碼SEQ ID NO: 1的蛋白的番茄植物是例如栽培種UC82B或其他。
[0090] 在一方面，SEQ ID NO: 1的功能性變體是編碼Genbank登錄號CAH56694、CAH56504 或CAH56693的蛋白質(zhì)的Acs4等位基因。編碼SEQ ID N0:1的功能性變體的番茄植物是例 如栽培種 San Marzano Vesuvio、San Marzano Nano 或 Tondino0
[0091] 在一方面，本發(fā)明涉及包含具有一個或多個突變的acs4等位基因的番茄種的栽 培植物和/或其部分（例如果實），所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功 能喪失或功能降低的突變acs4蛋白，其中與野生型完全功能性Acs4等位基因（編碼SEQ ID N0:1的功能性Acs4蛋白或功能性變體）純合型（Acs4/Acs4)的番前植物相比，所述一 個或多個突變導(dǎo)致降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的果實成熟和/或更長的貯藏期，其中所述 番茄植物不包含編碼Genbank登錄號CAH56694、CAH56504或CAH56693的蛋白質(zhì)的Acs4等 位基因。在另一方面，本發(fā)明植物的一個或多個突變導(dǎo)致與野生型Acs4等位基因純合型的 番茄相比降低的乙烯產(chǎn)生。
[0092] 在另一方面，本發(fā)明植物的一個或多個突變導(dǎo)致與野生型Acs4等位基因純合型 的番茄相比延遲的果實成熟和/或更長的貯藏期。
[0093] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含具有一個或多個突變的acs4等位基因的番茄種的 栽培植物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白，其中所述一個 或多個突變存在于"大結(jié)構(gòu)域"中，即在Acs4等位基因編碼的野生型、功能性Acs4蛋白的第 65-327位氨基酸區(qū)域的編碼部分中，并且所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Acs4蛋白相比acs4 蛋白功能喪失或功能降低的突變acs4蛋白，其中所述一個或多個突變導(dǎo)致與野生型Acs4 等位基因純合型的番茄相比降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的果實成熟和/或更長的貯藏期。 在一個優(yōu)選的方面中，所述一個或多個突變是SEQ ID NO: 1的第241至251位氨基酸的區(qū) 域內(nèi)和/或第304至327位氨基酸的區(qū)域內(nèi)的一個或多個氨基酸的置換、缺失和/或插入； 在另一個方面，所述一個或多個突變導(dǎo)致第200、201或203位氨基酸下游的大結(jié)構(gòu)域的一 部分或全部缺失，或所述突變導(dǎo)致截短的acs4蛋白，所述截短的acs4蛋白至少缺少第二小 結(jié)構(gòu)域和/或大結(jié)構(gòu)域的一部分，例如終止密碼子存在于SEQ ID NO:8的第600位核苷酸 后的任何位置處。
[0094] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的acs4等位基因的番茄植物，所述蛋白包含功能性"大結(jié)構(gòu)域"，即導(dǎo)致降低的乙烯產(chǎn)生和 /或延遲的成熟和/或延長的貯藏期的所述突變位于"大結(jié)構(gòu)域"外。因此，在一個實施方 案中，所述突變acs4等位基因在一個或兩個所述小結(jié)構(gòu)域中（來自包含功能性"大結(jié)構(gòu)域" 的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1變體的第33至62位和/或第339至438位氨基酸）包含 一個或多個突變，并且還在SEQ ID NO: 1的第33至62位和/或第339至438位氨基酸中 包含（核苷酸序列編碼的）至少一個氨基酸插入、缺失或置換，所述至少一個插入、缺失或 置換導(dǎo)致番茄植物果實的降低的乙烯產(chǎn)生和/或延遲的成熟和/或更長的貯藏期。
[0095] 在一個實施方案中，導(dǎo)致功能喪失的acs4蛋白或acs4蛋白的功能降低的一個或 多個突變位于野生型Acs4蛋白的"大結(jié)構(gòu)域"中，即所述蛋白包含功能性"小結(jié)構(gòu)域"，因此 在一個實施方案中，在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1變體的第65至327位氨基酸中一個或 多個氨基酸被插入、缺失或置換。在另一個實施方案中，導(dǎo)致功能喪失的acs4蛋白或acs4 蛋白的功能降低的一個或多個突變位于野生型Acs4蛋白的C-末端中，因此在一個實施方 案中，在SEQ ID N0:1(或SEQ ID N0:1變體）的第444至476位氨基酸中一個或多個氨基 酸被插入、缺失或置換。
[0096] 因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的番茄植物包含內(nèi)源性（非轉(zhuǎn)基因）突 變acs4等位基因，所述突變acs4等位基因編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降低的突變 acs4蛋白，由此所述植物的果實確實能夠成熟到紅熟期（優(yōu)選比編碼完全功能性Acs4蛋白 的野生型等位基因純合型的植物慢）。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的番茄植物包 含人工誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因突變acs4等位基因，所述突變acs4等位基因編碼功能降低的突變 acs4蛋白和/或功能喪失的acs4蛋白。在另一個實施方案中，這類突變acs4等位基因來 源自栽培的番茄（例如育種系、品種或傳統(tǒng)品種）或番茄的野生近緣種和/或在其中產(chǎn)生。 這種人工誘導(dǎo)的突變可以例如使用EP1963505中描述的定向誘變來誘導(dǎo)。隨后，番茄的野 生近緣種中產(chǎn)生的突變acs4等位基因可以很容易地通過育種轉(zhuǎn)入栽培的番茄中。
[0097] 在另一方面，本發(fā)明涉及具有編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的內(nèi)源性acs4等位基因的本發(fā)明植物，所述功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:1的變體具有基本序列同一性，其中所述蛋白包含一個或多 個氨基酸的置換、缺失和/或插入。
[0098] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含與野生型（Acs4/ACS4)植物相比降低的乙烯產(chǎn)生和 /或延遲的成熟和/或更長的貯藏期的本發(fā)明的植物，這是由于所述植物含有編碼功能喪 失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的內(nèi)源性acs4等位基因，所述功能喪失的acs4蛋 白或功能降低的acs4蛋白與SEQ ID N0:2或與SEQ ID N0:3或與SEQ ID N0:4或與SEQ ID N0:5或與SEQ ID N0:6或與SEQ ID N0:7具有基本序列同一性。在一個具體方面中， 本發(fā)明涉及含有acs4等位基因的栽培的番茄植物，所述acs4等位基因以一個或兩個拷 貝（即以純合或雜合的形式）存在于以登錄號NCMB 42034、NCMB 42037、NCMB 42038、 NCMB42039或NCMB 42041保藏的種子中。在雜合的形式中，另一個等位基因可以是野生 型Acs4等位基因或另一個突變acs4等位基因，例如來自本文所提供的其他突變體中的任 何一個，或是編碼本文所述的功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白的任何其他突 變acs4等位基因。因此，在雜合的形式中，所述另一個等位基因可以是功能降低的acs4等 位基因。
[0099] 在另一方面，本發(fā)明涉及內(nèi)源性acs4等位基因或涉及其編碼的功能喪失的acs4 蛋白或功能降低的acs4蛋白，所述功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白與SEQ ID N0:2 與或 SEQ ID N0:3 或與 SEQ ID N0:4 或與 SEQ ID N0:5 或與 SEQ ID N0:6 或與 SEQ ID N0:7具有基本序列同一性，所述等位基因或蛋白存在于（及來自于）以登錄號NCHffi 42034、NCMB 42037、NCMB 42038、NCMB 42039 或 NCMB 42041 保藏的種子中。
[0100] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的內(nèi)源性acs4等位基因的本發(fā)明的番茄植物，所述功能喪失的acs4蛋白或功能降低的 acs4 蛋白與 SEQ ID N0:2 或與 SEQ ID N0:3 或與 SEQ ID N0:4 或與 SEQ ID N0:5 或與 SEQ ID N0:6或與SEQ ID N0:7具有100%序列同一性。
[0101] 在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 的內(nèi)源性acs4等位基因的本發(fā)明植物，所述功能喪失的acs4蛋白或功能降低的acs4蛋白 在所述"大結(jié)構(gòu)域"中具有至少一個氨基酸缺失、插入或置換。優(yōu)選地，所述acs4蛋白包含 功能性小結(jié)構(gòu)域，例如SEQ ID NO: 1的小結(jié)構(gòu)域（第33至62位和/或第339至438位氨 基酸殘基）或SEQ ID N0:1的（功能性）變體的小結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述acs4 蛋白還包含SEQ ID NO: 1的C-末端（第444至476位氨基酸）或SEQ ID NO: 1的（功能 性）變體的C-末端。
[0102] 在一方面，所述acs4蛋白不長于203個氨基酸，優(yōu)選為開始的203個氨基酸。因 此，在一個實施方案中，所述番茄植物編碼截