用于高效基因組編輯的rna分子的設(shè)計(jì)、合成及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及核酸檢測領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及可用病毒、微生物、 動(dòng)植物等生物核酸序列的基因組編輯方法及用途。
【背景技術(shù)】：
[0002] 基因定點(diǎn)修飾一直是研究基因功能的重要手段之一，它也被用于人類遺傳性疾病 的治療中，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。早期僅基于同源重組的基因打 靶技術(shù)效率極低，應(yīng)用受到限制。
[0003] 鋅指核酸酶（ZFN的）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENS)的出現(xiàn)讓科學(xué)家 們可以高效地進(jìn)行基因定點(diǎn)修飾，被應(yīng)用于斑馬魚、小鼠、大鼠、豬等動(dòng)物模型中，實(shí)驗(yàn)證明 它們可以高效準(zhǔn)確地對基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾。但是這兩種技術(shù)所需的核酸序列，合成方法麻 煩，成本昂貴，無法進(jìn)行大規(guī)?；蚝Y選。
[0004] 2013年初，在原核生物中，CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromicrepealsandCRISPRassociated)最新進(jìn)展為基因定點(diǎn)修飾提供了一種制作 簡單、成本低廉、作用高效的方法。該系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中用于降解入侵的病毒和質(zhì)粒， 防止本體收到外來遺傳物質(zhì)的損害。CRISPR/Cas系統(tǒng)一共分為三種類型，Cas9屬于研究相 對清楚的II型系統(tǒng)，研究證實(shí)在原核生物中，Cas9需要同兩種小RNA(crRNA、tracrRNA)結(jié) 合對外源核酸進(jìn)行識(shí)別，直接剪切以達(dá)到保護(hù)自身的目的?？茖W(xué)家們?yōu)榱四軌虮阌诓僮?、?化實(shí)驗(yàn)體系，將crRNA和tracrRNA融合成一條相對較長的gRNA，實(shí)驗(yàn)證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 內(nèi)，Cas9由gRNA引導(dǎo)，可以對靶DNA進(jìn)行剪切。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)存在的問題：現(xiàn)有的Cas9/gRNA對靶基因的切割效率較低，一般在5%~ 30%之間，應(yīng)用會(huì)受到一定的限制。因此，開發(fā)新的gRNA，就成為本領(lǐng)域迫切需要解決的一 個(gè)技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的正是為了解決上述問題，希望通過對gRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些改進(jìn)，提 高Cas9/gRNA系統(tǒng)對靶向基因的切割效率。
[0007] 本發(fā)明所稱的"靶序列"是指gRNA5'端的20~24堿基的序列，這段序列與目的 DNA序列相同，gRNA需這段序列與目的DNA結(jié)合，cas9/gRNA復(fù)合體對目的DNA進(jìn)行剪切。
[0008] 本發(fā)明所稱的"RNA二級結(jié)構(gòu)"是指通過使用核酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件 RNAfold(Mathews等人（2004)，網(wǎng)址http: //rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold. cgi)預(yù)測得到的RNA二級結(jié)構(gòu)。
[0009] 本發(fā)明所稱的"基因組編輯"是指對生物的基因組DNA進(jìn)行刪除、插入或者替換， 從而達(dá)到對目的序列修改的目的。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0011] 本發(fā)明中設(shè)計(jì)針對HHB基因序列設(shè)計(jì)合成gRNA，采用的實(shí)驗(yàn)方法是國際上比較常 用的突光素酶單鏈重組退火實(shí)驗(yàn)（luciferasesingle-strandannealingrecombination assay，SSA)，和用來檢測內(nèi)源基因非同源重組檢測效率的方法-SURVEYOR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)原理 如附圖1、2所示。
[0012]gRNA是一個(gè)含有96堿基的RNA，如果用隨機(jī)合成的方法進(jìn)行篩選，將會(huì)有496種可 能，篩選工作量過于龐大，無法進(jìn)行。所以本發(fā)明中著眼于gRNA的第一個(gè)發(fā)卡結(jié)果進(jìn)行篩 選，利用質(zhì)粒不相容這一性質(zhì)進(jìn)行篩選。具體步驟如圖1所示。該方法首先建立篩選體系， 然后從第一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中按順序選取4個(gè)堿基合成NNNN的隨機(jī)序列建立gRNA庫，將cas9 表達(dá)質(zhì)粒和gRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌，在其中挑選陽性克隆擴(kuò)增， 最后與報(bào)告質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化進(jìn)行驗(yàn)證。我們設(shè)計(jì)的上述新方法使得篩選實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)量大大 減小，從而使得從大量可能的組合中挑選出有效的新型gRNA變得可行。
[0013] 使用上述方法，我們從上千種gRNA中挑選出了 10種最優(yōu)選的增強(qiáng)cas9/gRNA效 果的gRNA，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理概括出效果較好的gRNA結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們對現(xiàn)有的gRNA 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修改測試。
【附圖說明】
[0014] 圖1篩選實(shí)驗(yàn)流程示意圖。我們將cas9和gRNA構(gòu)建到同一個(gè)載體上，再通過共轉(zhuǎn) 化的方法，將其和報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)化到同一個(gè)大腸桿菌內(nèi)，有效果的gRNA會(huì)和cas9形 成復(fù)合體將含有報(bào)告基因載體上的靶序列剪切，此時(shí)會(huì)發(fā)生熒光素酶單鏈重組退火反應(yīng)， 報(bào)告基因會(huì)表達(dá)。我們經(jīng)過挑選報(bào)告基因表達(dá)的克隆來選取有效果的gRNA。為了進(jìn)行大規(guī) 模篩選，我們將gRNA庫構(gòu)建到載體上進(jìn)行篩選，從中挑取陽性克隆，提取gRNA質(zhì)粒，再進(jìn)行 下游重新驗(yàn)證。
[0015]圖 2 突光素酶單鏈重組退火實(shí)驗(yàn)（luciferasesingle-strandannealing recombinationassay，SSA)原理圖：首先，把突光素酶基因進(jìn)行改造。在突光素酶基因中間 加入終止密碼子和靶基因序列；隨后通過分子生物學(xué)手段再緊接上另外一段熒光素酶基因 序列，圖中淺灰色區(qū)域的序列（約800bp)相同。當(dāng)gRNA有效果時(shí)，Cas9/gRNA復(fù)合體會(huì)在 靶序列位置把雙鏈DNA剪切形成一個(gè)雙鏈的DNA斷裂，由于兩個(gè)淺灰色區(qū)域序列（即圖1中 "終止密碼子"左側(cè)的一段基因和"靶序列"右側(cè)的一段基因）相同，此時(shí)會(huì)發(fā)生同源重組， 就形成了一個(gè)有活性的熒光素酶報(bào)告基因，實(shí)驗(yàn)中可以測量熒光素酶的表達(dá)來檢測TALEN 的效果的強(qiáng)弱。
[0016] 圖3SURVEY0R原理圖：首先用PCR的方法把目的基因片段從基因組上擴(kuò)增出來。 其中包括發(fā)生缺失和沒有產(chǎn)生變化的序列。然后把擴(kuò)增出來的片段在體外進(jìn)行重新退火， 此時(shí)發(fā)生缺失的片段和沒有產(chǎn)生變化的序列會(huì)退火形成有部分不配對的雙鏈結(jié)構(gòu)。接下來 用SURVEYOR酶進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，這種酶可以識(shí)別不配對的區(qū)域進(jìn)行酶切。我們可以通過跑膠 檢測圖中a、b、c的含量來檢測發(fā)生缺失的效率，從而得出TALEN的作用效果。
[0017] 圖4gRNA修改1序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第1個(gè)堿基由 G變?yōu)閁，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA略有下降。
[0018] 圖5gRNA修改2序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第1個(gè)堿基由 G的配對序列由U突變?yōu)镃，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 基本不變。
[0019] 圖6gRNA修改3序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第1個(gè)堿基由 G的配對序列由U突變?yōu)锳，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9沒有剪切活性。
[0020] 圖7gRNA修改4序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第1個(gè)堿基由 G突變?yōu)锳，它的配對序列由U突變?yōu)锳，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9沒有剪切活 性。
[0021] 圖8gRNA修改5序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第1個(gè)堿基由 G突變?yōu)閁，它的配對序列由U突變?yōu)镚，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9沒有剪切活 性。
[0022] 圖9gRNA修改6序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第3、4、5個(gè)堿 基由UUU突變?yōu)镚CG，它們的配對序列由AAA突變?yōu)镃GC，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示， cas9沒有剪切活性。
[0023] 圖IOgRNA修改7序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第3個(gè)堿基 U配對序列由A突變?yōu)镃，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9沒有剪切活性。
[0024] 圖IlgRNA修改8序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第3、4、5個(gè) 堿基由UUU變?yōu)閁U，它們的配對序列AAA變?yōu)锳A，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9沒 有剪切活性。
[0025] 圖12gRNA修改9序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第7、8、9個(gè) 堿基由GAG變?yōu)锳CU，他們的互補(bǔ)序列變?yōu)棰荂，將泡補(bǔ)齊，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示， cas9沒有剪切活性。
[0026] 圖13gRNA修改10序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第8個(gè)堿基 由A變?yōu)锳AG，第21、22、23個(gè)堿基由AAG變?yōu)锳，將泡方向改變，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果 顯示，cas9沒有剪切活性。
[0027] 圖14gRNA修改11序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第21個(gè)堿基 A去掉，減少泡3'端的大小，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 有下降。
[0028] 圖15gRNA修改12序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第21、22個(gè) 堿基AA去掉，減少泡3'端的大小，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始 gRNA有下降。
[0029] 圖16gRNA修改13序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第8個(gè)堿基 A去掉，減少泡5'端的大小，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA 下降很明顯。
[0030] 圖17gRNA修改14序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將gRNA序列中第8個(gè)堿基 由A突變?yōu)镚，SSA結(jié)果和SURVEYOR結(jié)果顯示，cas9剪切效果相對原始gRNA有所升高。
[0031] 圖18gRNAl序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0032] 圖19gRNA2序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0033] 圖20gRNA3序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0034] 圖21gRNA4序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0035] 圖22gRNA5序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0036] 圖23gRNA6序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0037] 圖24gRNA7序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0038] 圖25gRNA8序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039] 圖26gRNA9序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040] 圖27gRNA10序列及SSA和SURVEYOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下將通過具體的實(shí)施例說明本發(fā)明，但是這些具體的實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為對本 發(fā)明的限制，對某些細(xì)節(jié)進(jìn)行修改將仍然落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例中使用的 gRNA堿基序列、被上述gRNA識(shí)別的目標(biāo)DNA中的片段的序列、以及cas9的氨基酸序列如 附錄所示。附錄中列出了 3組gRNA堿基序列和能被上述gRNA識(shí)別的DNA序列，實(shí)驗(yàn)中使 用的gRNA堿基序列和對應(yīng)的被gRNA識(shí)別的DNA序列是同一組的，但是并不限于某一個(gè)特 定的組。在實(shí)際應(yīng)用的時(shí)候，一般是知道目標(biāo)DNA序列后，選取目標(biāo)DNA序列中的一段作為 gRNA的識(shí)別位點(diǎn)，然