免疫抑制因子MNSFbeta基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及MNSF β基因缺陷的非人 雌性生育障礙哺乳動物模型及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胚胎著床(又稱植入）是指處于一定發(fā)育狀態(tài)的胚胎與處于接受狀態(tài)的子宮間的 相互作用，導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜建立緊密聯(lián)系并進一步發(fā)展的過程。在胚胎著床過 程中，胎盤細胞的侵入機制與癌細胞在體內(nèi)的浸潤與擴散機制相似。整合素 （Integrin)、 細胞粘附分子（Cell adhesion molecule)、細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix)和基質(zhì)金 屬蛋白酶(MMP)參與整個著床過程，并通過復(fù)雜的內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)環(huán) 境，但其確切的分子機制仍不是十分清楚（Murray MJ和Lessey BA, [J]· Semin Reprod En docrinol，1999. 17(3):ρ· 275-90)。
[0003] 小鼠單克隆非特異性抑制因子（Mouse Monoclonal Nonspecific Suppressor Factor，麗SF)最初發(fā)現(xiàn)由ConA活化的小鼠 T細胞雜交瘤所產(chǎn)生，作為一種具有非特異 性免疫反應(yīng)抑制作用的淋巴因子，不僅能抑制B細胞產(chǎn)生IgG的活性、抑制T細胞和B 細胞的增殖，而且能抑制Th2細胞的產(chǎn)生和IL-4的分泌，以及各種小鼠源腫瘤細胞的分 化（Nakamura M，Ogawa H 和 Tsunematsu T，[J]· Cell Immunol, 1988. 116(1):ρ· 230-9)。 MNSF 位于小鼠第 19 號染色體上（Lois A. Salamonsen*GN, Jock K. Findlay, [J]· Journal of Reproductive Immunology,2002.53:p.215-225)，至少由 α 和 β 兩個亞基組成， 其中麗SFP是麗SF發(fā)揮其生物功能的最主要成分，有報道認為麗SFP能通過抑制 TNF-a的合成來影響巨噬細胞的功能（Nakamura M，Xavier RM Eur J Immunol, 1995. 25(8):ρ· 2417-9 ;Xavier RM，Nakamura M 和 Tsunematsu T，[J]· J Immunol, 1994. 152(5):ρ· 2624-32 ;Nakamura M，Ogawa H 和 Tsunematsu T，[J]·J Immunol, 1987. 138(6):p. 1799-803 ;Nakamura M，Xavier RM，Tsunematsu T 等·，[J]· Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92 (8): p.3463-7)。MNSFP 基因全長 cDNA 為 574bp，編碼 133 個氨基酸殘基的蛋白，其蛋白分子中含有2個功能域，包括N端的泛素樣結(jié)構(gòu)域和C端的核 糖體蛋白S30樣結(jié)構(gòu)域。2000年Nie GY等首次發(fā)現(xiàn)，麗SFP基因在小鼠胚胎著床當(dāng)日的子 宮組織著床部位和非著床部位存在特異性表達差異，非著床位點的表達水平顯著高于著床 位點，由此他們認為，理論上講，MNSF β在胚胎著床部位的表達應(yīng)該上調(diào)才能有利于抑制母 胎間的免疫反應(yīng)，而實際上卻是下調(diào)，因而推測MNSF0雖然可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細 胞的增殖和分化，即使參與母胎界面的免疫調(diào)節(jié)，也不是直接發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)的（Nie GY，Li Y，Hampton AL等.，[J].Mol R印rod Dev，2000.55(4):p.351-63)，但該實驗室后來 未再有更多的關(guān)于MNSF0在胚胎著床中作用基質(zhì)的研究報道。
[0004] 綜上所述，從現(xiàn)有技術(shù)的研究可以看出，目前人們對MNSF0基因?qū)ε咛ブ布皯?孕期間的影響作用知之甚少，且認為其在胚胎著床過程中不是直接發(fā)揮免疫抑制作用。基 于現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)甚至可能得出MNSFii基因并非生殖必需基因的結(jié)論。
[0005] 此外，生殖過程，例如胚胎發(fā)育和胚胎著床等是非常復(fù)雜的過程，受到各種因素的 調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，利用一些在，例如胚胎和子宮內(nèi)膜等妊娠相關(guān)組織中特異性表達的基 因產(chǎn)物的特異性抗體抑制該基因產(chǎn)物可以使得相關(guān)動物產(chǎn)生生育障礙或異常，但敲除這些 基因卻對相關(guān)動物的生育不產(chǎn)生負面影響，換言之，在妊娠期間或在妊娠相關(guān)組織中特異 性表達的基因并不一定就是生殖必需的基因。例如，現(xiàn)有技術(shù)顯示ISP2(著床絲氨酸蛋白 酶2)具有子宮和胚胎組織特異性（O'Sullivan CM等，R印roduction, 2001，122:235-244 ; 周密等，《生殖與避孕》，2008, 28 :129-133)，而抗ISP2的抗體在小鼠體內(nèi)能夠有效抑制胚 胎著床（Huang ZP 等，R印rod Fertil Dev, 2004, 16:379-384)，但將對 ISP2 基因敲除小鼠 進行研究后卻顯示該基因并非生殖所必需的基因。
[0006] 因此，本領(lǐng)域急需MNSF β條件性基因敲除的哺乳動物模型，用來分析胚胎著床的 關(guān)鍵因素。因為與現(xiàn)有模型不同，其具有重要的科學(xué)意義和實用價值。此外，這樣的動物模 型可在研究免疫抑制以及著床障礙治療的同時，還能用于研究免疫障礙在腫瘤發(fā)生發(fā)展過 程中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種MNSFβ條件性基因敲除的非人哺乳動物模型的制備 方法以及該方法獲得的哺乳動物模型的相關(guān)應(yīng)用。
[0008] 在第一方面，本發(fā)明提供一種非人哺乳動物的雌性生育障礙動物模型的制備方 法，所述方法包括以下步驟：
[0009] 提供非人雌性哺乳動物的細胞，將所述細胞中的MNSF β基因失活，以及
[0010] 將所述MNSFβ基因失活的細胞再生形成所述雌性生育障礙哺乳動物模型。
[0011] 在具體的實施方式中，所述失活是通過基因剔除、基因中斷、或基因插入而造成 麗SFP基因失活。
[0012] 在優(yōu)選的實施方式中，所述MNSFβ基因失活包括MNSFβ基因不表達，或表達沒有 活性的麗SFP蛋白。
[0013] 在另一具體的實施方式中，所述非人哺乳動物包括嚙齒動物或靈長目動物，較佳 地，包括小鼠、大鼠、猴。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物的雌性生 育障礙動物模型的用途，所述動物模型用于篩選治療或改善雌性生育障礙的候選物質(zhì)。
[0015] 在優(yōu)選的實施方式中，所述雌性哺乳動物生育障礙包括胚胎著床障礙、胚胎發(fā)育 異常或流產(chǎn)。
[0016] 在【具體實施方式】中，所述動物模型用于篩選治療或改善后代中性別比例失調(diào)的候 選物質(zhì)。
[0017] 在第三方面，本發(fā)明提供MNSF β基因的用途，所述基因用于篩選治療或改善雌性 生育障礙的候選物質(zhì)。
[0018] 在優(yōu)選的實施方式中，所述雌性生育障礙包括胚胎著床障礙、胚胎發(fā)育異?；蛄?產(chǎn)。
[0019] 在具體的實施方式中，所述雌性生育障礙是后代中性別比例失調(diào)。
[0020] 在第四方面，本發(fā)明提供一種篩選治療或改善雌性生育障礙的候選物質(zhì)的方法， 所述方法包括以下步驟：
[0021] 將待測物質(zhì)施用給正常的非人哺乳動物或本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人 哺乳動物的雌性生育障礙動物模型；
[0022] 檢測麗SF β基因的表達或蛋白的活性；和
[0023] 與未施用待測物質(zhì)的對照組進行比較，其中若所述待測物質(zhì)導(dǎo)致MNSF0基因表 達或蛋白活性的上調(diào)，則表示待測物質(zhì)是治療或改善雌性生育障礙的候選物質(zhì)；
[0024] 或者
[0025] 將待測物質(zhì)施用給本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物的雌性生育障 礙動物模型；
[0026] 檢測TNFa的表達；和
[0027] 與未施用待測物質(zhì)的對照組進行比較，其中若所述待測物質(zhì)導(dǎo)致TNFa的表達下 調(diào)，則表示待測物質(zhì)是治療或改善雌性生育障礙的候選物質(zhì)。
[0028] 在優(yōu)選的實施方式中，所述雌性生育障礙包括胚胎著床障礙、胚胎發(fā)育異?；蛄?產(chǎn)。
[0029] 在優(yōu)選的實施方式中，所述雌性生育障礙是后代中性別比例失調(diào)。
[0030] 在優(yōu)選的實施方式中，所述施用是口服、經(jīng)皮或噴霧施用。
[0031] 在第五方面，本發(fā)明提供MNSF0基因的用途，所述基因用于篩選可用作避孕藥的 候選物質(zhì)。
[0032] 在第六方面，本發(fā)明提供一種篩選可用作避孕藥的候選物質(zhì)的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0033] 將待測物質(zhì)施用給正常的非人哺乳動物；
[0034] 檢測麗SF β基因的表達或蛋白的活性；和
[0035] 與未施用待測物質(zhì)的對照組進行比較，其中若所述待測物質(zhì)導(dǎo)致MNSF0基因表 達或蛋白活性的下調(diào)，則表示待測物質(zhì)是可用作避孕藥的候選物質(zhì)；
[0036] 或
[0037] 將待測物質(zhì)施用給本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物的雌性生育障 礙動物模型；
[0038] 檢測TNF a的表達；和
[0039] 與未施用待測物質(zhì)的對照組進行比較，其中若所述待測物質(zhì)導(dǎo)致TNFa表達上 調(diào)，則表示待測物質(zhì)是可用作避孕藥的候選物質(zhì)。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0041] 圖1顯示了麗SFP條件性基因剔除策略；
[0042] 圖2顯示了采用PCR對小鼠尾基因組的鑒定，其中1-16為小鼠編號；
[0043] 圖3顯示了麗SF β基因敲除小鼠基因型的PCR鑒定；
[0044] 圖4顯示了麗SFi3基因部分敲除的Fl代和F2代性別比例的比較；
[0045] 圖5顯示了麗SFP基因敲除對雌性或雄性小鼠生育力的影響；
[0046] 圖6顯示了野生型和雜合型小鼠子宮麗SFβ表達的比較；
[0047] 圖7顯示了野生型和雜合型小鼠子宮中麗SFP的表達情況；
[0048] 圖8顯示了雜合型與野生型小鼠懷孕14天的含胚胎子宮的比較；
[0049] 圖9顯示了雜合型小鼠懷孕14天子宮中正常胚胎和異常胚胎的