Cas9 介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體和應(yīng)用，首先，構(gòu)建含香石竹目標(biāo)基因靶位點的CRISPR?Cas9系統(tǒng)，將Cas9表達載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58菌株，再將香石竹葉片的基部放入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，22±2℃光照培養(yǎng)3?4天，將含Cas 9表達載體的農(nóng)桿菌活化，再將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸入已活化備好的農(nóng)桿菌菌液中20?30分鐘，吸干菌液，接著轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中，22±2℃暗培養(yǎng)3?4天，再轉(zhuǎn)置到篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，22±2℃光照培養(yǎng)，分化出再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖篩選培養(yǎng)，并檢測陽性轉(zhuǎn)基因再生植株，對靶位點進行測序，檢測香石竹目標(biāo)基因靶點的突變株系。
【專利說明】
Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] RNAi干擾技術(shù)和基因編緝技術(shù)是研究基因功能方法，RNAi介導(dǎo)的基因下調(diào)是減少 細胞中目的基因表達產(chǎn)物的最常用方法，然而，RNAi無法完全去除目的基因。與此相反，基 因組編輯技術(shù)改變遺傳密碼，引起基因敲除，W致完全缺失基因功能。目前，有兩種技術(shù)可 用于高效地形成雙鏈斷裂：TALENUranscription Activator-Uke Effector Nucleases) 和CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat Associated)蛋 白。TALEN是由帶特異結(jié)合位點的DNA結(jié)合蛋白和限制性內(nèi)切酶Fokl融合而成的嵌合體蛋 白。CRISPR-化S的作用機理是一個帶特異結(jié)合位點的sgRNA(single guide RNA)引導(dǎo)化s9 核酸酶到祀位點。兩種技術(shù)都是運用核酸酶來切割祀序列，所得到的雙鏈斷裂或被修復(fù)或 導(dǎo)致細胞死亡。TALEN技術(shù)構(gòu)建體系比較麻煩，化s9技術(shù)構(gòu)建體統(tǒng)簡單。
[0003] 香石竹別名康乃馨、廳香石竹，石竹科，石竹屬，宿根草本植物。香石竹是著名的 "母親節(jié)"之花。在香石竹中，目前有學(xué)者利用RNAi干擾技術(shù)研究香石竹基因功能，但轉(zhuǎn)基因 的效率低，且不能徹底敲掉目標(biāo)基因。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前基因工程技術(shù) 領(lǐng)域亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供了一種化s9介導(dǎo)的香石竹 基因編輯載體，與采用該編輯載體定向突變香石竹目標(biāo)基因的方法，本發(fā)明利用化s9技術(shù)， 在香石竹中實現(xiàn)特定位點的基因編緝，從而造成基因序列永久的突變，為研究基因功能奠 定基礎(chǔ)。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，包括Atue啟動子調(diào)控SgRNA表達的表達框Atue-SgRNA和2 X 35S啟動子調(diào)控化s9表達的表達框2 X 35SH：as9。
[0006] 本發(fā)明還要求保護所述化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體在香石竹基因功能研究 或香石竹基因工程育種中的應(yīng)用。
[0007] 一種定向突變香石竹基因的方法，采用上述化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，包 括W下步驟： 步驟(1)，構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體： 將Atue啟動子調(diào)控含祀序列的SgRNA表達的表達框和2 X 35S啟動子調(diào)控化s9表達的表 達框通過T4連接酶連入PCAMBIA1301載體中，得到化S 9表達載體，即Cas 9介導(dǎo)的香石竹基 因編輯載體;所述的Cas 9表達載體的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示；祀序列通過重疊 PCR法插入Atue-SgRNA表達框； 步驟(2)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹： 采用凍融法將步驟（1)構(gòu)建好的化s9表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，然后將含化s9表達載 體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻，得到含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌 液，置于-80°C冰箱內(nèi)保存； 步驟(3 )，香石竹外植體預(yù)培養(yǎng)： 取無菌的香石竹組培苗最頂端的1-3節(jié)葉片，將葉片的基部沿垂直于基部軸向切成2-5 毫米的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22±2°C條件下光照培養(yǎng)3-4天，得到預(yù)培養(yǎng)的葉片； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，薦糖30g/L，瓊脂9-llg/L，pH為5.8; 步驟(4)，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)： 將步驟(2)得到的含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌液20-5化L加入到添加卡那霉素和利福 平的YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C下，180-200 rmp振蕩培養(yǎng)16-20小時，得到活化的農(nóng)桿菌菌 液;所述的活化的農(nóng)桿菌菌液ODsoo值為0.5-0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液體 培養(yǎng)基是在Y邸液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為50-80mg/L，且同時添加利福平至終 濃度為 50-80mg/l; 步驟巧），香石竹遺傳轉(zhuǎn)化： 在搖床上，將步驟(3)預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入步驟(4)得到的活化的農(nóng)桿菌菌液中，W50-80 rmp的速度振蕩，20-30分鐘后取出；將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，然后將葉 片轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在22±2°C條件下暗培養(yǎng)3-4天，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，進行篩選 培養(yǎng)，40-60天更換培養(yǎng)基一次，待分化出叢生的再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行 增殖篩選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因再生植株； 所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，薦 糖30g/L，瓊脂 9-1 Ig/L，抑為5.8; 所述的篩選培養(yǎng)基為 MS 巧 DZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+ Hyg 6-lOmg/L，薦糖30g/L，瓊脂9-1 Ig/L，抑為5.8。
[000引所述的增殖培養(yǎng)基為MS+BA O-O.lmg/L+NAA O-O.lmg/L+ Hyg 6-lOmg/L，薦糖 30邑/1，瓊脂9-11邑/1，抑為5.8; 步驟(6)，香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證： 提取步驟巧)增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，采用PCR法擴增化S 9片斷（可 擴增全部化S 9片斷，也可擴增部分化S 9片斷），能擴增出化S 9片斷的植株為陽性轉(zhuǎn)基因 再生植株;然后在祀位點兩端設(shè)計引物，擴增陽性轉(zhuǎn)基因再生植株含目標(biāo)祀點的DNA片斷， 測序法檢測祀點的編輯情況。
[0009] 進一步，優(yōu)選的是所述農(nóng)桿菌選用根癌農(nóng)桿菌巧8。
[0010] 進一步，優(yōu)選的是步驟（1)的構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體的具體方法如 下： 采用KpnI/Sall 雙酶切AtU6-26SK質(zhì)粒，Sall/EcoRI 雙酶切35S-Cas9-SK質(zhì)粒和KpnI/ EcoRI雙酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒，并分別回收=種雙酶切產(chǎn)物，采用T4連接酶在16°C下將= 種的雙酶切產(chǎn)物連接16小時，采用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過PCR法篩選陽性 克隆，并進行測序驗證，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表達載體。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為： 本發(fā)明利用新型的基因編緝系統(tǒng)CRISPR-Cas系統(tǒng)，對香石竹目標(biāo)基因進行定向編緝， 可W獲得基因功能缺失的突變體，為香石竹基因功能的研究及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育優(yōu)良性 狀的種質(zhì)打下基礎(chǔ)。
[0012] 本發(fā)明在香石竹中建立了一種定向突變目標(biāo)基因的方法，與RNAi技術(shù)相比，實現(xiàn) 在香石竹中特定位點的定向基因編緝，從而造成基因序列永久的缺失;Cas 9技術(shù)與TALEN 技術(shù)相比，具有操作簡單，耗時較短，可縮短一倍的時間，費用較低，費用可節(jié)省60-70%，運 為基因功能的研究W及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來培育新品種奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0013] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖： 圖1利用重疊 PCR技術(shù)拼接含祀序列的SgRNA表達盒電泳圖。A : 1-2為PrimerFl和 Primer2105Rl引物擴增SgRNA表達盒部分片斷；B: 1-2為Primer2105F2和PrimerR2引物擴 增SgRNA表達盒部分片斷；C: 1-2為引物PrimerFl和PrimerR2進行重疊 PCR擴增含2105S 個祀點的SgRNA表達盒。MiMarker。
[0014] 圖2為化S 9載體構(gòu)建過程示意圖； 圖3為含目標(biāo)祀點的Cas 9載體PCR鑒定結(jié)果電泳圖；其中，M:Marker; 1 -4:4個單克隆 SgRNA表達盒PCR鑒定;5-8:4個單克隆化s9表達盒PCR鑒定;9-12:4個單克隆潮霉素基因 PCR 鑒定。
[001引圖4農(nóng)桿菌中Cas9表達盒部分片斷的PCR鑒定結(jié)果電泳圖；其中，M:Marker;l-4:4 個單克隆化s9表達盒PCR鑒定;5:水對照。
[0016]圖5為2105化S 9載體的轉(zhuǎn)基因再生植株P(guān)CR鑒定結(jié)果電泳圖；其中，1-12:12株增 殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株P(guān)CR鑒定;WT:野生型；一：陰性水對照;+ :陽性大腸桿菌 液對照;M:Marker. 圖6為轉(zhuǎn)基因陽生再生植株祀點DNA片斷擴增結(jié)果電泳圖，1-7:7株陽性植株祀點DNA片 斷擴增產(chǎn)物;8:水對照。
[0017] 圖7為編緝祀點的測序圖，序列圖顯示N〉S和I〉M突變；圖中標(biāo)出protospacer和 PAM位置，W及氨基酸編碼的序列。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過購買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0020] AtU6-26SK和35S-化S9-SK質(zhì)粒由上海植物逆境生物學(xué)研究中屯、朱健康研究員饋 贈，S排NA表達盒和Cas9表達盒的序列見文章 （Feng Z，Zhang B，Ding W，Liu X，Yang D, Wei P, Cao F， Zhu S, Zhang F， Mao Y et al. 2013. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/C^s system. Cell Res 23(10): 1229-1232.)0
[0021] 如果沒有特別指出，百分號為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，溶液的溶劑為水。
[0022] 下面對本發(fā)明技術(shù)方案進行詳細說明，但是本發(fā)明的保護范圍不局限于所述實施 例。
[0023] 實施例1 (1)構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體 1)采用重疊 PCR擴增含2105祀點的SgRNA表達盒。
[0024] 第一輪PCR: WAtU6-26SK為模板，分別 WPrime巧 1 和Primer2105Rl、Primer2105F2 和PrimerR2為引物，用TransStad化9〇臟化Iymerase進行特異PCR擴增出500多bp的片 斷和100多bp的二個片斷。擴增體系皆為50微升， 其中PCR反應(yīng)體系：上下游引物各為1微升，dNTP 4微升，模板DNA 1微升，TransStart I^qDNA Polymerase 1微升，IOXbuffer 5微升，補加雙蒸水至50微升。
[0025] 反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性10分鐘，94 °C 30秒，64 °C 30秒，72 °C 30分鐘，共 35個循環(huán)，72 °C再延伸10分鐘。
[0026] 第二輪PCR: W擴增出500多bp的片斷和100多bp的二個片斷為模板，用引物 PrimerFl和PrimerRS進行重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴增含有目的片斷的S曲NA表達盒。反應(yīng) 分兩步進行，第一步，在50微升體系中加500多bp的片斷和100多bp的二個片斷各1微升， dNTP 4微升，TransStart I'aqDNAPolymerase 1 微升，10 X buffer 5微升，加水至50微升， 反應(yīng)條件為94 °C預(yù)變性10分鐘，94 °C 30秒，64 °C 30秒，72 °C30秒，共10個循環(huán)，72 °C再延伸10分鐘；第二步:在第一步50微升反應(yīng)體系中補加物Prime巧1和PrimerR2引物各 1微升，反應(yīng)循環(huán)為30個。（圖1) 將含有2105祀位點序列的DNA片斷連入祀ASY-Blunt Cloning Vector克隆載體(北京 全式金），挑選陽性克隆并測序。測序與祀位點序列一致的為陽性克隆。
[0027] 2)構(gòu)建化S 9和SgRNA表達盒的雙價表達載體 提取 DcPSl 基因含 2105 祀點的 AtU6-26SK、35S-Cas9-SK 和 PCAMBIA1301 質(zhì)粒。
[00巧]0。？51基因2105祀點的核巧酸序列為5'-旨1:1:。1旨1:。曰1曰旨旨旨。旨曰1:1旨旨旨旨-3'（56〇10 NO.2)2105祀點為沈Q ID NO. 1 的第 16646-第 16665堿基。
[00巧]采用KpnI/Sall 雙酶切AtU6-26SK質(zhì)粒，Sall/EcoRI 雙酶切35S-Cas9-SK質(zhì)粒和 KpnI/EcoRI雙酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒。回收雙酶切產(chǎn)物，T4連接酶(肥B)16°C連接16小時， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞（圖2)。挑取白色大腸桿菌，放入2毫升氨節(jié)抗性的 液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C 200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)16小時，得到黃色的菌液。
[0030] 所述的氨節(jié)抗性的液體培養(yǎng)基的制備方法是:將10克膜蛋白腺、5克酵母粉和10克 化Cl加入到水中，并定容至1升，調(diào)pH為7.0,于121°C下，高壓滅菌20min，冷卻后加入100毫 克/毫升的氨節(jié)青霉素水溶液1毫升，即得。
[0031] 采用PCR鑒定陽性克隆，分別在SgRNA表達盒、Cas9表達盒和潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶 (Hyg)基因上設(shè)計1對引物。SgRNA表達盒部分片斷擴增采用的引物為ATU6-26SK-1IF和 ATU6-26SK-645R;Cas9表達盒部分片斷擴增所采用的引物為35SCAS9-701F和35SCAS9-1460R;潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(Hyg)基因部分片斷擴增HYG-35F和HYG-727R; PCR反應(yīng)體系： 菌液1微升；
[0032] Ps: 6種引物的濃度均為10微摩爾/升，加入的體積均為I微升 PCR反應(yīng)條件：95 °C 5分鐘，95 °C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分鐘，35個循環(huán)，72 °C 5分鐘。
[0033] 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，S對引物均擴增出目地條帶的為1個陽性克隆（圖3)。 良 PATU6-26SK-11F 和 ATU6-26SK-645R 引物擴增出 63 加 P 的條帶，35SCAS9-701F 和 35SCAS9-1460R引物擴增出760bp的條帶，HYG-35F和HYG-727R引物引物擴增出693bp的條帶。
[0034] 測序鑒定，選取=對引物擴增片斷大小正確的3個陽性克隆送去上海捷瑞生物技 術(shù)有限公司測序，使用的測序引物為ATU6-26SK-645R，所測序列與2105祀點堿基序列相同 的克隆為陽性克隆。
[003引表r引物的序列。
[0036] 其中FP為上游引物，RP為下游引物。
[0037] (2)化s9表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 采用凍融法將構(gòu)建好的化S 9表達載體轉(zhuǎn)入巧8農(nóng)桿菌。具體操作如下：向冰上剛?cè)诨?的50微升農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中加入1微克化S 9表達載體質(zhì)粒DNA，混勻后冰上放置30分鐘， 液氮速凍5分鐘，37 °C水浴3分鐘至全融，冰上放置2分鐘，加入到1毫升Y邸液體培養(yǎng)基中，28 °C，200轉(zhuǎn)/分恢復(fù)培養(yǎng)3小時，5000轉(zhuǎn)/分離屯、3分鐘，收集菌體，均勻涂于事先加有50毫克/ 升卡那抗性和50毫克/升利福平的Y邸平板上，28°C倒置避光培養(yǎng)2天。
[0038] 所述的Y邸液體培養(yǎng)基的制備方法是將5克膜蛋白腺、1克酵母粉、5克薦糖和0.5克 MgS化，一起加入到水中，并采用化OH調(diào)節(jié)抑，最終定容至1升，抑為7.2-7.5，再于12rC高壓 滅菌20分鐘，即得。
[0039] 上述卡那抗性和利福平的Y邸平板的制備方法是將5克膜蛋白腺、1克酵母粉、5克 薦糖、O . 5克MgS化和瓊脂1.5克，一起加入到水中，調(diào)抑，定容至100毫升，抑為7.2-7.5，再 于12rC高壓滅菌20分鐘，接著冷卻到60°C時加入50毫克/毫升的卡那霉素水溶液100微升 和50毫克/毫升利福平水溶液100微升，倒平板，即得 從平板上隨機挑取10個單菌落，分別接種于50毫升含50毫克/升卡那抗性和50毫克/升 利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，該含卡那抗性和利福平的YEB液體培養(yǎng)基的制備方法是:將5克 膜蛋白腺、1克酵母粉、5克薦糖和0.5克MgS〇4，一起加入到水中，并采用化OH調(diào)節(jié)pH，最終 定容至1升，抑為7.2-7.5，再于12rC高壓滅菌20分鐘，冷卻后加入50毫克/毫升的卡那霉素 水溶液1毫升和50毫克/毫升利福平水溶液1毫升，即得。
[0040] 28°C，200轉(zhuǎn)/分恒溫振蕩培養(yǎng)2天，取少量菌液進行PCR擴增鑒定。
[0041 ] PCR反應(yīng)體系：
[0042] PCR反應(yīng)條件：95 °C 5分鐘，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘，35 個循 環(huán)，72 °C 5分鐘。
[0043] PCR擴增鑒定結(jié)果（圖4)。
[0044] 將鑒定的化S 9表達載體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻， 置于-80 °C冰箱內(nèi)保存。
[0045] (3)香石竹外植體預(yù)培養(yǎng) 在超凈工作臺上，取無菌的香石竹組培苗'馬斯特'葉片，用綴子小屯、撕下最頂端1-3節(jié) 葉片，將葉片的基部橫切成2-5毫米的薄片，薄層背面朝下接種于MS巧DZ(苯基嚷二挫基脈） 0.5 111邑/1+酷4(糞乙酸)0.5 111邑/1，薦糖30邑/1，瓊脂9-11邑/1，抑為5.8預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中， 24 °C條件下光照培養(yǎng)4天。
[0046] (4)農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng) 吸取含化S 9表達載體的農(nóng)桿菌菌液20化接種于30毫升Y邸液體培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)，YEB 液體培養(yǎng)基中添加終濃度50毫克/升卡那霉素和終濃度50毫克/升利福平，28°C條件下，180 rmp振蕩培養(yǎng)16小時，當(dāng)ODsoo為0.5時，得到含化S 9表達載體的農(nóng)桿菌菌液，用于農(nóng)桿菌浸 染。
[0047] (5)香石竹遺傳轉(zhuǎn)化 將預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入到含化S 9表達載體的農(nóng)桿菌菌液30分鐘，此過程放在搖床上，80 rmp不斷振蕩W使菌液與外植體充分接觸。將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，轉(zhuǎn) 入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L +AS(乙酷下香酬）20 mg/L，薦糖30 g/L，瓊脂 11 g/ L，pH為5.8的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在24°C條件下暗培養(yǎng)4天，再轉(zhuǎn)入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L + 400 mg/L Cef(頭抱氨嚷朽）+ 6 mg/L Hyg，薦糖30 g/L，瓊脂 11 g/L，pH為 5.8篩選培養(yǎng)基中，進行篩選培養(yǎng)，60天更換成新的篩選培養(yǎng)基，待分化出再生芽，將再生芽 轉(zhuǎn)入MS+BA(6-節(jié)氨基嚷嶺）0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L + 6 mg/L Hyg,薦糖30 g/L，瓊脂 11g/L，抑為5.8增殖培養(yǎng)基中進行增殖篩選培養(yǎng)。
[004引（6 )香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證 香石竹化基因化S 9表達載體采用PCR法驗證陽性轉(zhuǎn)基因再生植株和測序法檢測對 祀點是否切割。首先提取增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株的DNA進行PCR擴增；
[0049] PCR反應(yīng)條件：95 °C 5分鐘，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘，35 個循 環(huán)，72 °C 5分鐘。
[0050] 引物擴出含目的條帶(與' + '泳道擴增條帶相一致的條帶）的片斷為陽性轉(zhuǎn)基因再 生植株(圖5)，1、7、8、9泳道能擴出條帶，為陽性轉(zhuǎn)基因再生植株。對93株增殖篩選培養(yǎng)得到 的轉(zhuǎn)基因再生植株進行篩選，共檢測到27株陽性轉(zhuǎn)基因再生植株，占到所有再生植株的 29〇/〇。
[0化1 ] W陽性轉(zhuǎn)基因再生植株基因組DNA為模板進行PCR擴增；
[0052] PCR反應(yīng)條件：95 °C 5分鐘，95 °C 30秒，58 °C 30 秒，72 °C 1 分鐘，35 個循 環(huán)，72 °C 5分鐘。
[0053] 將擴增得到的含祀序列的560bp的DNA片斷（圖6)，克隆到PMD18T載體(Takara)并 進行測序檢測。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有4株植株的祀位點出現(xiàn)了單堿基突變，其中，兩株發(fā)生 氨基酸的突變，兩株未產(chǎn)生氨基酸的變異，Cas 9表達載體對祀點進行了編緝，產(chǎn)生了基因 突變(圖7)。
[0054] 實施例2 一種定向突變香石竹基因的方法，采用化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，包括W下步 驟： 步驟(1)，構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體： 將Atue啟動子調(diào)控SgRNA表達的表達框和2 X 35S啟動子調(diào)控化s9表達的表達框通過T4 連接酶連入PCAMBIA1301載體中，得到化S 9表達載體;所述的化S 9表達載體的核巧酸序列 如沈Q ID NO. 1所示； 步驟(2)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹： 采用凍融法將步驟（1)構(gòu)建好的化s9表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，然后將含化s9表達載 體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻，得到含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌 液，置于-80°C冰箱內(nèi)保存； 步驟(3 )，香石竹外植體預(yù)培養(yǎng)： 取無菌的香石竹組培苗最頂端的1節(jié)葉片，將葉片的基部沿垂直于基部軸向切成2毫米 的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22±2°C條件下光照培養(yǎng)3天，得到預(yù)培養(yǎng)的葉片； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L，薦糖30 g/L，瓊脂9 g/L，pH 為 5.8; 步驟(4)，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)： 將步驟(2)得到的含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌液20iiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C下，200rmp振蕩培養(yǎng)16小時，得到活化的農(nóng)桿菌菌液;所述的活化 的農(nóng)桿菌菌液ODsoo值為0.5;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基是在YEB液體 培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為80mg/L，且添加利福平至終濃度為80mg/l; 步驟巧），香石竹遺傳轉(zhuǎn)化： 在搖床上，將步驟（3)預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入步驟(4)得到的活化的農(nóng)桿菌菌液中，W50 rmp的速度振蕩，30分鐘后取出；將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，然后將葉片 轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在22±2°C條件下暗培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，進行篩選培 養(yǎng)，40天更換培養(yǎng)基一次，待分化出叢生的再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖篩 選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因再生植株； 所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS巧DZ O.lmg/L+NAA O.lmg/L+AS 20mg/L，薦糖30g/L，瓊脂 9邑/1，抑為5.8; 所述的篩選培養(yǎng)基為MS巧DZ O.lmg/L+NAA O.lmg/L+ Cef 300 mg/L+ Hyg 6mg/L，薦 糖30邑/1，瓊脂9邑/1，抑為5.8。
[0055]所述的增殖培養(yǎng)基為MS+BA Omg/L+NAA Omg/L+ Hyg 6mg/L，薦糖30g/L，瓊脂9g/ 1，抑為5.8; 步驟(6)，香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證： 提取步驟巧)增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，采用PCR法擴增化S 9片斷，能 擴增出化S 9片斷的植株為陽性轉(zhuǎn)基因再生植株;然后在祀位點兩端設(shè)計引物，擴增陽性轉(zhuǎn) 基因再生植株含目標(biāo)祀點的DNA片斷，測序法檢測祀點的編輯情況。
[0056] 實施例3 一種定向突變香石竹基因的方法，采用化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，包括W下步 驟： 步驟(1)，構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體： 采用KpnI/Sall 雙酶切AtU6-26SK質(zhì)粒，Sall/EcoRI 雙酶切35S-Cas9-SK質(zhì)粒和KpnI/ EcoRI雙酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒，并分別回收=種雙酶切產(chǎn)物，采用T4連接酶在16°C下將= 種的雙酶切產(chǎn)物連接16小時，采用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過PCR法篩選陽性 克隆，并進行測序，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表達載體； 步驟(2)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹： 采用凍融法將步驟（1)構(gòu)建好的化s9表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，然后將含化s9表達載 體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻，得到含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌 液，置于-80°C冰箱內(nèi)保存； 步驟(3 )，香石竹外植體預(yù)培養(yǎng)： 取無菌的香石竹組培苗最頂端的3節(jié)葉片，將葉片的基部沿垂直于基部軸向切成5毫米 的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22±2°C條件下光照培養(yǎng)4天，得到預(yù)培養(yǎng)的葉片； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.3mg/L +NAA 0.3mg/L，薦糖30g/L，瓊脂llg/L，抑為 5.8; 步驟(4)，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)： 將步驟(2)得到的含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌液SOiiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C下，190rmp振蕩培養(yǎng)20小時，得到活化的農(nóng)桿菌菌液;所述的活化 的農(nóng)桿菌菌液ODsoo值為0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基是在YEB液體 培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為50mg/L，且添加利福平至終濃度為50mg/l; 步驟巧），香石竹遺傳轉(zhuǎn)化： 在搖床上，將步驟（3)預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入步驟(4)得到的活化的農(nóng)桿菌菌液中，W80 rmp的速度振蕩，20分鐘后取出；將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，然后將葉片 轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在22±2°C條件下暗培養(yǎng)4天，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，進行篩選培 養(yǎng)，60天更換培養(yǎng)基一次，待分化出叢生的再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖 篩選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因再生植株； 所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+AS 30 mg/L，薦糖30g/L，瓊 脂11邑/1，抑為5.8; 所述的篩選培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ Cef 400 mg/L+ Hyg lOmg/L，薦 糖30邑/1，瓊脂11邑/1，抑為5.8。
[0057]所述的增殖培養(yǎng)基為MS+BA O.lmg/L+NAA O.lmg/L+ Hyg lOmg/L，薦糖30g/L，瓊 脂11邑/1，抑為5.8; 步驟(6)，香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證： 提取步驟巧)增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，采用PCR法擴增化S 9片斷，能 擴增出化S 9片斷的植株為陽性轉(zhuǎn)基因再生植株;然后在祀位點兩端設(shè)計引物，擴增陽性轉(zhuǎn) 基因再生植株含目標(biāo)祀點的DNA片斷，測序法檢測祀點的編輯情況。
[0化引實施例4 一種定向突變香石竹基因的方法，采用化s9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，包括W下步 驟： 步驟(1)，構(gòu)建化S 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體： 采用KpnI/Sall 雙酶切AtU6-26SK質(zhì)粒，Sall/EcoRI 雙酶切35S-Cas9-SK質(zhì)粒和KpnI/ EcoRI雙酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒，并分別回收=種雙酶切產(chǎn)物，采用T4連接酶在16°C下將= 種的雙酶切產(chǎn)物連接16小時，采用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過PCR法篩選陽性 克隆，并進行測序，得到核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的化S 9表達載體； 步驟(2)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹： 采用凍融法將步驟（1)構(gòu)建好的化s9表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，然后將含化s9表達載 體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻，得到含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌 液，置于-80°C冰箱內(nèi)保存； 步驟(3 )，香石竹外植體預(yù)培養(yǎng)： 取無菌的香石竹組培苗最頂端的2節(jié)葉片，將葉片的基部沿垂直于基部軸向切成4毫米 的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22±2°C條件下光照培養(yǎng)3.5天，得到預(yù)培養(yǎng)的葉片； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.2mg/L +NAA 0.2mg/L，薦糖30g/L，瓊脂lOg/L，抑為 5.8; 步驟(4)，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)： 將步驟(2)得到的含化s9表達載體的農(nóng)桿菌菌液40iiL加入到添加卡那霉素和利福平的 YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C下，ISOrmp振蕩培養(yǎng)18小時，得到活化的農(nóng)桿菌菌液;所述的活化 的農(nóng)桿菌菌液ODsoo值為0.7;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基是在YEB液體 培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為60mg/L，且添加利福平至終濃度為60mg/l; 步驟巧），香石竹遺傳轉(zhuǎn)化： 在搖床上，將步驟（3)預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入步驟(4)得到的活化的農(nóng)桿菌菌液中，W66 rmp的速度振蕩，25分鐘后取出；將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，然后將葉片 轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在22±2°C條件下暗培養(yǎng)3.7天，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，進行篩選培 養(yǎng)，50天更換培養(yǎng)基一次，待分化出叢生的再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行增殖篩 選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因再生植株； 所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 25 mg/L，薦糖30g/L，瓊 脂9.5邑/1，抑為5.8; 所述的篩選培養(yǎng)基為MS巧DZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+ Cef 380 mg/L+ Hyg 8mg/L，薦 糖30g/L，瓊脂 9.8g/L，pH為5.8。
[0059] 所述的增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.06mg/L+NAA 0.08mg/L+ Hyg 7mg/L，薦糖30g/L，瓊 脂10.5邑/1，抑為5.8; 步驟(6)，香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證： 提取步驟巧)增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，采用PCR法擴增化S 9片斷，能 擴增出化S 9片斷的植株為陽性轉(zhuǎn)基因再生植株;然后在祀位點兩端設(shè)計引物，擴增陽性轉(zhuǎn) 基因再生植株含目標(biāo)祀點的DNA片斷，測序法檢測祀點的編輯情況。
[0060] W上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，運些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等效物界定。
[0061 ] 序列表








【主權(quán)項】
1 .Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體，其特征在于：包括AtU6啟動子調(diào)控sgRNA表達的 表達框AtU6-sgRNA和2 X 35S啟動子調(diào)控Cas9表達的表達框2 X 35S-Cas9。2. 權(quán)利要求1任一項所述Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體在香石竹基因功能研究或 香石竹基因工程育種中的應(yīng)用。3. -種定向突變香石竹基因的方法，采用權(quán)利要求1所述的Cas9介導(dǎo)的香石竹基因編 輯載體，其特征在于，包括以下步驟： 步驟(1)，構(gòu)建Cas 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體： 將AtU6啟動子調(diào)控含靶序列的sgRNA表達的表達框和2X35S啟動子調(diào)控Cas9表達的表 達框通過T4連接酶連入PCAMBIA1301載體中，得到Cas 9表達載體;所述的Cas 9表達載體的 核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示;靶序列通過重疊 PCR法插入AtU6-sgRNA表達框； 步驟(2 )，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹： 采用凍融法將步驟（1)構(gòu)建好的Cas9表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，然后將含Cas9表達載 體的農(nóng)桿菌與相同體積的50 V/V %甘油水溶液混合均勻，得到含Cas9表達載體的農(nóng)桿菌菌 液，置于-80 °C冰箱內(nèi)保存； 步驟(3 )，香石竹外植體預(yù)培養(yǎng)： 取無菌的香石竹組培苗最頂端的1-3節(jié)葉片，將葉片的基部沿垂直于基部軸向切成2-5 毫米的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，22±2°C條件下光照培養(yǎng)3-4天，得到預(yù)培養(yǎng)的葉片； 所述的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0·l-0·5mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂9-llg/L，pH為5·8; 步驟(4 )，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)： 將步驟(2)得到的含Cas9表達載體的農(nóng)桿菌菌液20-50yL加入到添加卡那霉素和利福 平的YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C下，180-200 rmp振蕩培養(yǎng)16-20小時，得到活化的農(nóng)桿菌菌 液;所述的活化的農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.5-0.8;所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液體 培養(yǎng)基是在YEB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為50-80mg/L，且同時添加利福平至終 濃度為 50-80mg/L; 步驟(5)，香石竹遺傳轉(zhuǎn)化： 在搖床上，將步驟(3)預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入步驟(4)得到的活化的農(nóng)桿菌菌液中，以50-80 rmp的速度振蕩，20-30分鐘后取出；將葉片放在滅過菌的濾紙上吸干多余的菌液，然后將葉 片轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在22±2°C條件下暗培養(yǎng)3-4天，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，進行篩選 培養(yǎng)，40-60天更換培養(yǎng)基一次，待分化出叢生的再生芽，將再生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中進行 增殖篩選培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因再生植株； 所述的共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，蔗 糖30g/L，瓊脂 9-1 lg/L，pH為5 · 8; 所述的篩選培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+ Hyg 6-10mg/L，鹿糖30g/L，瓊脂9-llg/L，pH為5.8; 所述的增殖培養(yǎng)基為MS+BA 〇-〇.lmg/L+NAA 〇-〇.lmg/L+ Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L， 瓊脂9-118/1，？!1為5.8; 步驟(6)，香石竹陽性轉(zhuǎn)基因再生植株的驗證： 提取步驟(5)增殖篩選培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)基因再生植株DNA，采用PCR法擴增Cas 9片斷，能 擴增出Cas 9片斷的植株為陽性轉(zhuǎn)基因再生植株;然后采用PCR法擴增陽性轉(zhuǎn)基因再生植株 含靶序列的DNA片斷，測序法檢測靶序列的編輯情況。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定向突變香石竹目標(biāo)基因的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌選 用根癌農(nóng)桿菌C58。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定向突變香石竹目標(biāo)基因的方法，其特征在于：步驟（1)的構(gòu) 建Cas 9介導(dǎo)的香石竹基因編輯載體的具體方法如下： 采用KpnI/Sall雙酶切含靶序列的AtU6-26SK質(zhì)粒，Sall/EcoRI雙酶切35S-Cas9-SK 質(zhì)粒和KpnI/EcoRI雙酶切PCAMBIA1301質(zhì)粒，并分別回收三種雙酶切產(chǎn)物，采用T4連接酶 在16°C下將三種的雙酶切產(chǎn)物連接16小時，采用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過 PCR法篩選陽性克隆，并進行測序驗證，得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的Cas 9表達 載體。
【文檔編號】C12N15/84GK105838733SQ201610333623
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】周旭紅, 朱健康, 蘇艷, 王繼華, 李姝影, 田敏, 趙丹丹
【申請人】云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所