人源化抗c-met 拮抗劑的制作方法
【專利說明】人源化抗C-MET拮抗劑
[0001] 本申請是申請日為2005年08月04日、中國申請?zhí)枮?01210336983. 7(原申請?zhí)?200580033792. 1)、發(fā)明名稱為"人源化抗C-MET拮抗劑"的發(fā)明分案申請的再分案申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 此申請是根據(jù)37 CFR 1.53(b) (1)提交的非臨時申請，根據(jù)35 USC 119(e)要求 2004年8月5日提及的臨時申請60/598, 991的優(yōu)先權(quán)，將其完整內(nèi)容收入本文作為參考。
[0004] 生物材料的保藏
[0005] 以下生物材料已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA) (ATCC)：
[0006] 保藏物 保藏日期 保藏編號
[0007] 雜交瘤，1A3.3.13 1995-05-23 HB-11894
[0008] 雜交瘤，5D5.11.6 1995-05-23 HB-11895
技術(shù)領(lǐng)域
[0009] 一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生長因子調(diào)控領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明涉及 HGF/c-met信號途徑的調(diào)節(jié)物，及所述調(diào)節(jié)物的用途。
[0010] 背景
[0011] HGF是間充質(zhì)衍生的多效因子，對許多不同細(xì)胞類型具有促有絲分裂、促運(yùn)動 和促形態(tài)發(fā)生活性。HGF作用是通過特定的酪氨酸激酶c-met介導(dǎo)的，而且在多種腫 瘤中經(jīng)常觀察到異常HGF和c-met表達(dá)。參見例如Maulik et al.，Cytokine&Growth Factor Reviews(2002), 13:41-59 ；Danilkovitch-Miagkova&Zbar, J. Clin. Invest. (2002)，109(7) :863-867。在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中牽涉HGF/c-Met信號途徑的調(diào)控。參見例 如 Trusolino&Comoglio, Nature Rev. (2002)，2:289_300〇
[0012] HGF結(jié)合Met受體酪氨酸激酶（RTK)的胞外域并調(diào)控不同生物學(xué)過程，諸如細(xì) 胞分散、增殖和存活。HGF-Met信號傳導(dǎo)對于正常胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的，尤其是在肌 肉祖細(xì)胞迀移及肝和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中（Bladt et al·，1995 ;Hamanoue et al·，1996; Maina et al·，1996 ;Schmidt et al·，1995 ;Uehara et al·，1995)。Met 和 HGF 敲除小 鼠的發(fā)育表型非常相似，表明HGF是Met受體的關(guān)聯(lián)配體（Schmidt et al.，1995 ;Uehara et al.，1995)。HGF-Met還在肝再生、血管發(fā)生和傷口愈合中發(fā)揮作用（Bussolino et al.，1992 ;Matsumoto and Nakamura, 1993 ;Nusrat et al.，1994)。Met 受體前體經(jīng)蛋白水 解切割成由二硫鍵連接的胞外α亞基和跨膜β亞基（Tempest et al.，1988)。β亞基包 含胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，而且在C末端包含多底物?？课稽c(diǎn)，銜接物蛋白質(zhì)在此結(jié)合并起動信 號傳導(dǎo)（Bardelli et al.，1997 ;Nguyen et al.，1997 ;Pelicci et al.，1995 ;Ponzetto et al.，1994 ;Weidner et al.，1996)。HGF 結(jié)合后，Met 活化分別經(jīng)由 Gabl 和 Grb2/Sos 介導(dǎo)的PI3激酶和Ras/MAPK活化而導(dǎo)致酪氨酸磷酸化和下游信號傳導(dǎo)，它驅(qū)動細(xì)胞運(yùn)動 和增殖（Furge et al.，2000 ;Hartmann et al.，1994 ;Ponzetto et al.，1996 ;Royal and Park, 1995) 〇
[0013] Met據(jù)顯示在經(jīng)致癌原處理的骨肉瘤細(xì)胞系中正在轉(zhuǎn)化（Cooper et al.，1984 ; Park et al.，1986)。已在多種人癌癥中觀察到Met過表達(dá)或基因擴(kuò)增。例如，Met蛋白在 結(jié)腸直腸癌中過表達(dá)至少5倍，且據(jù)報道在肝轉(zhuǎn)移中有基因擴(kuò)增（Di Renzo et al.，1995; Liu et al.，1992)。Met蛋白據(jù)報道還在口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、乳癌和肺 癌中過表達(dá)（Jin et al.，1997 ;Morello et al.，2001 ;Natali et al.，1996 ;01ivero et al.，1996 ;Suzuki et al.，1994)。此外，已在肝細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌中觀察到mRNA 過表達(dá)（Boix et al.，1994 ;Kuniyasu et al.，1993 ;Liu et al.，1992) 〇
[0014] 已在腎乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)Met激酶結(jié)構(gòu)域中的許多突變，它們導(dǎo)致組成性受體活 化（Olivero et al.，1999 ;Schmidt et al.，1997 ;Schmidt et al.，1999)。這些活化突 變造成組成性Met酪氨酸磷酸化，并導(dǎo)致MAPK激活、病灶形成和腫瘤發(fā)生（Jeffers et al·，1997)。此外，這些突變增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動和侵入（Giordano et al·，2000 ;Lorenzato et al.，2002)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中HGF依賴性Met活化介導(dǎo)運(yùn)動、分散和迀移增加，最終導(dǎo)致侵入性 腫瘤生長和轉(zhuǎn)移（Jeffers et al.，1996 ;Meiners et al.，1998) 〇
[0015] Met已顯示與驅(qū)動受體活化、轉(zhuǎn)化和侵入的其它蛋白質(zhì)相互作用。在腫瘤細(xì)胞中， Met據(jù)報道與κ 6 κ 4整聯(lián)蛋白相互作用以促進(jìn)HGF依賴性侵入性生長，κ 6 κ 4整聯(lián)蛋白是 胞外基質(zhì)（ECM)組分諸如層粘連蛋白的受體（Trusolino et al.，2001)。此外，Met胞外 域已顯示與腦信號蛋白家族的成員叢蛋白Bl相互作用，且增強(qiáng)侵入性生長（Giordano et al.，2002)。而且，已知牽涉腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的⑶44v6據(jù)報道也與Met和HGF形成復(fù)合物 并導(dǎo)致 Met 受體活化（Orian-Rousseau et al.，2002) 〇
[0016] Met是包括Ron和Sea在內(nèi)的RTK亞家族的成員（Maulik et al·，2002)。Met胞 外域的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明它與腦信號蛋白和叢蛋白共享同源性。Met的N末端包含約500個 氨基酸的Sema結(jié)構(gòu)域，它在所有腦信號蛋白和叢蛋白中是保守的。腦信號蛋白和叢蛋白 屬于首先因其在神經(jīng)發(fā)育中的作用而描述的一個分泌和膜結(jié)合蛋白質(zhì)大家族（Van Vactor and Lorenz, 1999)。不過，新近將腦信號蛋白過表達(dá)與腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)起來。在叢蛋 白、腦信號蛋白和整聯(lián)蛋白中發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸PSI結(jié)構(gòu)域（也稱為Met相關(guān)序列結(jié)構(gòu) 域）鄰近Sema結(jié)構(gòu)域，隨后是4個IPT重復(fù)片段，它們是在叢蛋白和轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)的免 疫球蛋白樣區(qū)。最近的研宄表明Met Sema結(jié)構(gòu)域足以使HGF和肝素結(jié)合（Gherardi et al·，2003)。此外，Kong-Beltran 等人（Cancer Cell (2004)，6:61-73)報道了 Met 的 Sema 結(jié)構(gòu)域是受體二聚化和活化所必需的。
[0017] 已報道了靶向HGF/c-met途徑的許多分子。這些分子包括抗體，諸如那些美國專 利5, 686, 292中所描述的。c-met胞外域的一部分據(jù)顯示還具有針對HGF/c-met途徑的拮 抗作用。不過，考慮到該途徑在各種病理狀態(tài)的病因?qū)W中所發(fā)揮的重要作用，顯然繼續(xù)需要 具有最適于開發(fā)成治療劑的臨床特性的藥劑。本文描述的發(fā)明滿足這一需求并提供了其它 好處。
[0018] 完整收入本文引用的所有文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物，作為參考。
[0019] 發(fā)明公開
[0020] 本發(fā)明部分基于HGF/c-met生物學(xué)途徑的多種拮抗劑的鑒定，該途徑是呈現(xiàn)為重 要且有利治療靶的生物學(xué)/細(xì)胞過程。本發(fā)明提供了以干擾HGF/c-met活化為基礎(chǔ)的組合 物和方法，包括但不限于干擾HGF與c-met胞外部分結(jié)合及受體多聚化。如本文所述，本發(fā) 明的拮抗劑為靶向與異?；虿幌胍腍GF/c-met途徑信號傳導(dǎo)有關(guān)的病理狀況提供了重 要的治療劑和診斷劑。因此，本發(fā)明提供了與調(diào)節(jié)HGF/c-met途徑有關(guān)的方法、組合物、試 劑盒和制品，包括調(diào)節(jié)c-met配體結(jié)合、c-met二聚化、活化及其它與HGF/c-met信號傳導(dǎo) 有關(guān)的生物學(xué)/生理學(xué)活動。
[0021] 一方面，本發(fā)明提供了適于治療用途且能實(shí)現(xiàn)HGF/c-met信號途徑不同程度破壞 的抗HGF/c-met治療劑。例如，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人源化抗c-met抗體，其 中所述抗體對人c-met的單價親和力（例如Fab片段形式的抗體對人c-met的親和力）與 包含圖7中所示輕鏈和重鏈可變區(qū)序列（SEQ ID NO:9和10)、由其組成或基本上由其組成 的鼠抗體的單價親和力（例如Fab片段形式的鼠抗體對人c-met的親和力）基本上相同。 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人源化抗c-met抗體，其中所述抗體對人c-met的單 價親和力（例如Fab片段形式的抗體對人c-met的親和力）低于包含圖7中所示輕鏈和 重鏈可變區(qū)序列（SEQ ID NO:9和10)、由其組成或基本上由其組成的鼠抗體的單價親和力 (例如Fab片段形式的鼠抗體對人c-met的親和力），例如至少低3、5、7或10倍。在另一 個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗c-met人源化抗體，其中所述抗體對人c-met的單價親和力 (例如Fab片段形式的抗體對人c-met的親和力）高于包含圖7中所示輕鏈和重鏈可變區(qū) 序列（SEQ ID NO:9和10)、由其組成或基本上由其組成的鼠抗體的單價親和力（例如Fab 片段形式的鼠抗體對人c-met的親和力），例如至少高3、5、7、10或13倍。在一個實(shí)施方 案中，鼠抗體對人c-met的單價親和力與下述Fab片段的結(jié)合親和力基本上相同，所述Fab 片段包含于1995年5月23日以美國典型培養(yǎng)物保藏中心登記號ATCC HB-11894(雜交瘤 1A3. 3. 13)或HB-11895(雜交瘤OT5. 11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系所生成的抗體的可變區(qū)序 列。正如本領(lǐng)域完全確立的，配體對其受體的結(jié)合親和力可使用多種測定法中的任一種來 測定，并以各種定量數(shù)值形式表示。因此，在一個實(shí)施方案中，結(jié)合親和力以Kd值表示，反 映內(nèi)在結(jié)合親和力（例如具有最小化的親合力效應(yīng)）。普遍且優(yōu)選的是，結(jié)合親和力在體外 測量，無論是無細(xì)胞設(shè)置或細(xì)胞相關(guān)設(shè)置。正如本文更為詳細(xì)描述的，結(jié)合親和力的倍數(shù)差 異可量化成人源化抗體的單價結(jié)合親和力數(shù)值（例如Fab形式）與參照/比照抗體（例如 具有供體高變區(qū)序列的鼠抗體）的單價結(jié)合親和力數(shù)值（例如Fab形式）的比率，其中結(jié) 合親和力數(shù)值是在相似測定條件下測定的。因此，在一個實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的倍數(shù)差 異確定為Fab形式的人源化抗體與所述參照/比照Fab抗體的Kd值比率。例如，在一個實(shí) 施方案中，如果本發(fā)明的抗體（A)具有比參照抗體（M) "低3倍"的親和力，那么若A的Kd 值是3x，則M的Kd值將是lx，且A的Kd與M的Kd的比率將是3:1。相反，在一個實(shí)施方 案中，如果本發(fā)明的抗體（C)具有比參照抗體（R) "高3倍"的親和力，那么若C的Kd值是 lx，則R的Kd值將是3x，且C的Kd與R的Kd的比率將是1: 3。本領(lǐng)域已知的許多測定法中 的任一種，包括那些本文所描述的，都可用于獲取結(jié)合親和力的測量值，包括例如Biacore、 放射免疫測定法（RIA)和ELISA。
[0022] -方面，本發(fā)明的HGF/c-met詰抗劑包含抗c-met抗體，它包含：
[0023] (a)至少一種、兩種、三種、四種或五種選自下組的高變區(qū)（HVR)序列：
[0024] (i)包含序列 A1-A17 的HVR-L1，其中 A1-A17 是KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID N0:1)
[0025] (ii)包含序列 B1-B7 的 HVR-L2,其中 B1-B7 是 WASTRES(SEQ ID N0:2)
[0026] (iii)包含序列 C1-C9 的 HVR-L3,其中 C1-C9 是 QQYYAYPWT(SEQ ID N0:3)
[0027] (iv)包含序列 Dl-DlO 的 HVR-H1，其中 Dl-DlO 是 GYTFTSYWLH(SEQ ID N0:4)
[0028] (V)包含序列 E1-E18 的 HVR-H2,其中 E1-E18 是 GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO: 5)，及
[0029] (vi)包含序列 Fl-Fll 的 HVR-H3,其中 Fl-Fll 是 XYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:6)且 X不是R ;
[0030] 及（b)至少一種變體HVR，其中所述變體HVR序列包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5或 6中所示序列的至少一個殘基的修飾。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的HVR-Ll包含SEQ ID NO: 1的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的HVR-L2包含SEQ ID NO:2的序列。在 一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的HVR-L3包含SEQ ID NO:3的序列。在一個實(shí)施方案中，本 發(fā)明抗體的HVR-Hl包含SEQ ID NO:4的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的HVR-H2 包含SEQ ID NO: 5的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的HVR-H3包含SEQ ID NO:6的 序列。在一個實(shí)施方案中，HVR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:7)。在一個實(shí)施方案中， HVR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:8)。在一個實(shí)施方案中，包含這些序列（本文所述組 合）的本發(fā)明抗體是人源化的或人源的。
[0031] -方面，本發(fā)明提供了包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR的抗體，其中 各個HVR包含選自下組的序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7 和 8,其中 SEQ ID NO: 1 對應(yīng)于 HVR-