從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用從動(dòng)物組織提取黏蛋白領(lǐng)域，尤其是一種從豬小腸黏膜提取肝素 后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，利用豬小腸黏膜肝素加工后的廢棄物中提取高唾液酸含 量黏蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 黏蛋白（mucin)是一類(lèi)高度糖基化的蛋白，它由蛋白和寡糖鏈兩部分組成，且糖 鏈含量一般在50%~80%之間。該類(lèi)黏蛋白寡糖鏈主要以0-連接的形式與蛋白骨架上的 絲氨酸（Ser)或蘇氨酸（Thr)結(jié)合，稱(chēng)之為0-糖鏈。大量研宄表明，正常動(dòng)物小腸黏膜上皮 細(xì)胞表面黏液層中含有大量黏蛋白，除了具有保護(hù)上皮細(xì)胞免受物理或化學(xué)損傷外，還參 與預(yù)防多種疾病的發(fā)生和發(fā)展的功能，如預(yù)防囊腫纖維化癥（Cystic Fibrosis，CF)、粘液 腺癌、炎癥性腸炎等。黏蛋白上的0-糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，活性廣泛，在小腸細(xì)胞間相互作用、信 號(hào)調(diào)控、分子運(yùn)輸?shù)戎邪l(fā)揮重要的調(diào)控作用，直接影響生物體的生長(zhǎng)發(fā)育與疾病的預(yù)防。雖 然各種來(lái)源黏蛋白的結(jié)構(gòu)與活性是近年來(lái)的研宄熱點(diǎn)，但由于黏蛋白資源短缺，分離困難， 市場(chǎng)上銷(xiāo)售的只有科研用的牛頒下腺黏蛋白。
[0003] 我國(guó)是全球粗品肝素主要生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，其原料多以豬小腸黏膜為主，其下腳 料蛋白殘?jiān)鼣?shù)量相當(dāng)可觀(guān)，多被當(dāng)做廢棄物處理，造成環(huán)境的破壞及資源的浪費(fèi)。經(jīng)文獻(xiàn) 檢索，除了有學(xué)者利用豬小腸蛋白渣制備小分子肽及氨基酸將其作為飼料添加劑外（舒夏 娃，豬小腸黏膜加工下腳料酶解工藝的研宄，中國(guó)飼料，2007,6:34-36)，沒(méi)有從豬小腸粘膜 廢棄蛋白中制備含高唾液酸含量黏蛋白的報(bào)道，也沒(méi)有披露任何相關(guān)專(zhuān)利技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從豬小腸黏膜肝素加工后廢棄物中提取黏蛋白的方 法，其提取過(guò)程中產(chǎn)生的小肽及氨基酸可以用作動(dòng)物飼料。因此，該方法可以實(shí)現(xiàn)肝素、黏 蛋白、動(dòng)物飼料三聯(lián)產(chǎn)，提高產(chǎn)品附加值，解決資料浪費(fèi)與環(huán)境污染問(wèn)題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 一種從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，該方法包括以下步 驟：
[0007] (1)酶解：將豬小腸黏膜肝素加工廢棄物懸浮于Tris-HCl緩沖液中，升溫至37°C， 加入胰蛋白酶，恒溫?cái)嚢杳附?，酶解結(jié)束后，煮沸，使酶失活；
[0008] (2)醇沉：將（1)中所得酶解液離心，上清液中加入乙醇進(jìn)行沉淀，靜置12~24h， 收集沉淀，上清液旋蒸濃縮，烘干，用作動(dòng)物飼料；
[0009] (3)透析：將（2)中沉淀用蒸餾水復(fù)溶，轉(zhuǎn)入透析袋中，透析，去除小分子物質(zhì)，透 析結(jié)束后，將透析內(nèi)液旋蒸濃縮，凍干，獲得黏蛋白粗提物；
[0010] ⑷純化：將⑶所得黏蛋白粗提物用蒸餾水溶解，以蒸餾水和不同濃度的氯化鈉 水溶液為流動(dòng)相，經(jīng)強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂分離純化，硫酸苯酚法檢測(cè)，合并收集含有黏蛋白的 組分，蒸餾水透析，減壓濃縮，凍干，獲得高純度黏蛋白。
[0011] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，該方法獲得的 黏蛋白分子量分布范圍為200~lOOOkDa，蛋白質(zhì)含量為20~30wt%，總糖含量50~ 80wt% ;總糖由氨基半乳糖（GalN)、氨基葡萄糖（GlcN)、半乳糖（Gal)、巖藻糖（Fuc)和唾 液酸（NeuAc)組成，且唾液酸是總糖重量的24%~54%。
[0012] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，總糖中除了唾液 酸外，其他單糖組成包括：GalN、GlcN、Gal和Fuc，且GalN、GlcN、Gal和Fuc的重量比例為 23 ~45 :27 ~32 :14 ~15 :9 ~10。
[0013] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，步驟（1)中， Tris-HCl緩沖液的濃度為0. 05~0. 15mol/L，pH為7~9,胰蛋白酶用量為廢棄物投料質(zhì) 量的1%~5%。
[0014] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，步驟（2)中，所 使用的乙醇體積濃度為90 %~95 %，加入量為上清液體積的3~5倍。
[0015] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，步驟（3)中，選 用的透析袋截留量為14000Da，透析時(shí)間為48~72h，期間每隔3~5小時(shí)換一次水；或者， 米用lOOOODa超濾膜在超濾儀設(shè)備上進(jìn)彳丁濃縮脫鹽。
[0016] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，步驟（4)中，所 選用的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂為Q-Sepharose FF或者Capto Q。
[0017] 所述的從豬小腸黏膜提取肝素后的廢棄物中提取黏蛋白的方法，步驟（4)中，黏 蛋白粗提物用蒸餾水溶解上樣后，用〇. 5~1. 2mol/L的氯化鈉水溶液先后洗脫2~4個(gè)柱 體積，收集洗脫液，濃縮透析除鹽后，凍干，得高純度黏蛋白。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：
[0019] (1)本發(fā)明以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為初始原料提取獲得具有生物活性的高 純度黏蛋白，從豬小腸黏膜下腳料中提取含高唾液酸含量黏蛋白。其中，原料來(lái)源為豬小腸 黏膜肝素加工蛋白廢棄物，資源豐富，儲(chǔ)備量大，安全可靠。
[0020] (2)本發(fā)明以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為初始原料，經(jīng)胰蛋白酶酶解、乙醇沉淀 及強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂純化可獲得高純度的黏蛋白，該工藝路線(xiàn)簡(jiǎn)單，成本低廉，產(chǎn)品得率相 對(duì)于廢棄物投料重量1 %~5%。
[0021] (3)本發(fā)明以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為初始原料，從中提取具有生物活性的 高純度黏蛋白，除對(duì)肝素產(chǎn)品的制備無(wú)影響外，在提取過(guò)程中所產(chǎn)生的小分子肽和氨基酸 還可繼續(xù)用作動(dòng)物飼料。因此，本發(fā)明可以達(dá)到肝素、黏蛋白及動(dòng)物飼料三聯(lián)產(chǎn)的效果，提 高豬小腸的綜合利用，增加產(chǎn)品附加值，為肝素生產(chǎn)企業(yè)廢棄物再利用等處理提供新途徑， 減少環(huán)境污染，保護(hù)環(huán)境的同時(shí)為企業(yè)帶來(lái)新的經(jīng)濟(jì)效益。
[0022] (4)本發(fā)明以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為初始原料，所制備的具有生物活性的 黏蛋白不僅可作為科研用黏蛋白生物試劑，也可用作制備人和動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑及神經(jīng)細(xì)胞 營(yíng)養(yǎng)劑，具有重要的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1本發(fā)明黏蛋白的醋酸纖維素薄膜電泳分析圖。
[0024] 圖2本發(fā)明黏蛋白的十八角度激光散射儀分析圖。其中，橫坐標(biāo)時(shí)間單位是分鐘， 縱坐標(biāo)相對(duì)標(biāo)尺的單位是相對(duì)空白溶液的折光指數(shù)（△ RI)。
[0025] 圖3本發(fā)明黏蛋白的紅外光譜分析圖。
[0026] 圖4本發(fā)明黏蛋白的唾液酸含量測(cè)定圖。
[0027] 圖5本發(fā)明的黏蛋白單糖組成分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明所提供的從豬小腸黏膜肝素加工廢棄物中提取高純度 黏蛋白的方法，包括以下步驟：
[0029] (1)酶解：將豬小腸黏膜肝素加工廢棄物浸泡于Tris-HCl緩沖液中，升溫至37°C， 加入胰蛋白酶，恒溫?cái)嚢杳附?，酶解結(jié)束后，煮沸，使酶失活；
[0030] (2)醇沉：將⑴所得酶解液離心，上清液中加入乙醇進(jìn)行沉淀，靜置12~24h，收 集沉淀，上清旋蒸濃縮，烘干，用作動(dòng)物飼料；
[0031] (3)透析：將（2)中沉淀用蒸餾水復(fù)溶，轉(zhuǎn)入透析袋中，透析，去除鹽等小分子物 質(zhì)，透析結(jié)束后，將透析內(nèi)液旋蒸濃縮，凍干，獲得黏蛋白粗提物；
[0032] (4)純化：將（3)所得黏蛋白粗提物用蒸餾水溶解，以蒸餾水和不同濃度的氯化 鈉水溶液為流動(dòng)相，經(jīng)強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂分離純化，硫酸苯酚法檢測(cè)，合并收集含有黏蛋白 的組分，蒸餾水透析，減壓濃縮，凍干，獲得高純度黏蛋白。所述高純度黏蛋白的分子量為 200~lOOOkDa，蛋白質(zhì)含量為20~30wt %，總糖含量50~80wt %;醋酸纖維素薄膜電泳檢 測(cè)條帶均一，凝膠滲透色譜檢測(cè)洗脫峰單一對(duì)稱(chēng)，唾液酸含量占總糖重量的24%~54%。
[0033] 步驟（1)中，豬小腸黏膜肝素加工廢棄物浸泡于濃度為0? 05~0? 15mol/L，pH為 7~9的Tris-HCl緩沖液中，溫度升至37°C時(shí)，加入廢棄物投料質(zhì)量1 %~5%的胰蛋白 酶，攪拌提取，后經(jīng)煮沸滅活胰蛋白酶。步驟（2)中，向酶解上清液中加入的乙醇體積濃度 為90 %~95%，加入量為上清液體積的3~5倍進(jìn)行醇沉。步驟（3)中，醇沉所得沉淀用 蒸餾水復(fù)溶后，選用的透析袋截留量為14000Da，透析時(shí)間為48~72h，期間每隔3~5小 時(shí)換一次水。步驟（4)中，所選用的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂為Q-Sepharose FF或者Capto Q，黏 蛋白粗提物用蒸餾水溶解上樣后，用〇. 5~1. 2mol/L的氯化鈉水溶液先后洗脫2~4個(gè)柱 體積，收集洗脫液，濃縮透析除鹽后，凍干，得高純度黏蛋白。
[0034] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明要 求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。
[0035]實(shí)施例1
[0036] 稱(chēng)量豬小腸黏膜肝素加工廢棄物10g，浸泡于400mL pH 8. 0,濃度為0? lmol/L的 Tris-HCl緩沖液中，升溫至37°C，加入胰蛋白酶（胰蛋白酶的用量為廢棄物投料質(zhì)量的 3% )，攪拌下進(jìn)行酶解4h后，將溫度升至100°C，保持10min，滅活胰蛋白酶，4500r/min離 心，去除沉淀，上清液減壓濃縮至約100mL，加入4倍體積的95 %乙醇（體積濃度），攪拌， 〇~4°C靜置12h，沉淀用蒸餾