強度為50 μ mo I.πΓ2.?200 μ mo I.πΓ2.s'培養(yǎng)條件進一步優(yōu)選12h光照與12h黑暗交替，溫度19°C?23°C，光照強度150 ymol.m_2.s'在每IL初始配制的培養(yǎng)基中包含如下組分:Img ?10mg NaNO3, Img ?50mg NaH2PO4.2Η20，Img ?50mg Na2EDTA, Img ?50mg FeCl3.6Η20，0.01 μ g ?Img CuSO4.5Η20，0.01 μ g ?Img ZnSO4.7Η20，0.01 μ g ?ImgCoCl2.6Η20，0.01 μ g ?Img MnCl2.4Η20，0.0001 μ g ?Img Na2MoO4.2Η20，0.0001 μ g ?Img維生素Β12，0.01 μ g?1mg維生素BI和0.0001 μ g?Img維生素H，初始配制的培養(yǎng)基即是微藻還未接種且CHES或Tris緩沖液還未添加時配制的培養(yǎng)基，隨著微藻生長的進行，培養(yǎng)基中的各組分的含量會有所變化。進一步優(yōu)選的是，每IL培養(yǎng)基中包含如下組分:75mgNaNO3, 5.65mg NaH2PO4.2Η20，4.16mg Na2EDTA, 3.15mg FeCl3.6Η20，0.0lmg CuSO4.5H20，0.022mg ZnSO4.7H20，0.0lmg CoCl2.6H20，0.18mg MnCl2.4H20，0.006mg Na2MoO4.2H20，0.0005mg維生素B12，0.1mg維生素BI和0.0005mg維生素Η。
[0033]本發(fā)明的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法尤其是指促進海洋微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，以下以三角褐指藻藻種的培養(yǎng)為例，對本發(fā)明進行詳細闡述。
[0034]實施例一:不同pH值處理組對海洋微藻生長生理狀態(tài)的評價
[0035]在光照、溫度、接種密度等一致的情況下(本例中:培養(yǎng)條件為12h光照與12h黑暗交替，溫度21°C，光照強度150μπιΟ1.πΓ2.s'每IL初始配制的培養(yǎng)基中包含如下組分:75mg NaNO3, 5.65mg NaH2PO4.2Η20，4.16mg Na2EDTA, 3.15mg FeCl3.6Η20，0.0lmgCuSO4.5Η20，0.022mg ZnSO4.7H20，0.0lmg CoCl2.6H20，0.18mg MnCl2.4H20，0.006mgNa2MoO4.2H20，0.0005mg維生素B12，0.1mg維生素BI和0.0005mg維生素H。接種密度為0.5X 16?1.0X10 6個/mL，本例中約為1.0X10 6個/mL)，控制單因子變量，即微藻培養(yǎng)基的PH值，接種時設置I?5號五種不同的pH值處理，其中I號作為對照組，3號?5號作為處理組，每組處理設置3個平行，并隨機擺放培養(yǎng)瓶的位置以減少誤差。
[0036]I號:不對培養(yǎng)基中的pH值進行改變，作為對照組。
[0037]2號:利用HCl/NaOH調節(jié)，使培養(yǎng)基的pH值維持在8.0，簡寫為Unbuffered8.0，每天需要人為調節(jié)。
[0038]3號:利用Tris緩沖液調節(jié)，使培養(yǎng)基的pH值維持在8.0，簡寫為Trisbuffered8.0 ；
[0039]4號:利用CHES緩沖液調節(jié)，使培養(yǎng)基的pH值維持在9.5，簡寫為CHESbuffered9.50
[0040]5號:接種時，添加Tris緩沖液，使培養(yǎng)基的pH值維持在8.0，進入穩(wěn)定期時，再添加CHES緩沖液，使培養(yǎng)基的pH值維持在9.5，簡寫為Tris buffered8.0+CHESbuffered9.5。
[0041]評價指標:(I)細胞密度:每天同一時間測I?5號的細胞密度，為了減少誤差，每組處理設置3個平行，每個平行測3次細胞密度。采用血球計數板計數的方法，根據公式:細胞密度=(N/80) X 400 X 104，N代表80個網格單元中細胞的數目。(2)葉綠素含量:測量前將微藻樣品暗適應15-20min，光照ls，按照浮游植物分類熒光儀ΡΗΥΤ0-ΡΑΜ說明書進行檢測。
[0042]多次實驗結果表明，2號比較費時、費力，細胞密度、葉綠素含量較對照組明顯降低(如圖1A和IB所不)；3號、4號和5號的細胞密度、葉綠素含量較I號沒有明顯變化(如圖2A和2B所示)，說明利用緩沖液體系不但省時省力，還不會抑制微的藻生長。
[0043]實施例二:不同pH值處理組對海洋微藻油脂含量的評價
[0044]仍采用實施例一中的I?5號五種不同的pH值處理。
[0045]評價指標:(I)利用油脂熒光染料尼羅紅(NR，Sigma)的熒光強度來反映海洋微藻細胞的相對油脂含量，在200 yL微藻細胞中，加入2 yL的0.lmg/mL尼羅紅溶液，黑暗處理20min，通過流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測尼羅紅(NR，Sigma)的熒光強度，激光共聚焦顯微鏡測得的結果如圖34、3八’、38、38’、3(:、3(:’、30和3D’所示，流式細胞儀檢測的結果如圖4A、4B、4C、4D和4E所示。(2)提取脂肪酸，提取方法參考經典方法(Zh1-Kai Yang, Ying-Fang Niu, Yu-Han Ma, Jiao Xue, Meng-Han Zhang, We1-DongYang, Jie-Sheng Liu, Song-Hui Lul, Yuanfang Guan* and Hong-Ye Li*.Molecular andcellular mechanisms of neutrallipid accumulat1n in diatom followingnitrogendeprivat1n.B1technology for B1fuels 2013，6:67)。最終油脂含量(干重)％ =抽提藻細胞總油脂重量/藻細胞干重*100%，如圖5所示。
[0046]多次實驗結果表明:1、與I號相比，3號的相對油脂含量相當于I號的1.8-2.5倍，4號的相對油脂含量相當于I號的2.6-3.2倍，所以較佳的是4號。2、5號采用兩步法，將I號和4號、5號相比，4號和5號約是I號的3.0倍，但考慮到省時省力，由于5號需要在不同的生長時期加入不同的緩沖液，因此4號較5號優(yōu)。
[0047]以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:將微藻接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在所述培養(yǎng)基中添加N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液，添加所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液后所述培養(yǎng)基的PH值始終維持在9.0?10.0之間。
2.如權利要求1所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液是在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時就添加到所述培養(yǎng)基。
3.如權利要求1所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:在將所述微藻接種到所述培養(yǎng)基時，在所述培養(yǎng)基中加入Tris緩沖液，使所述培養(yǎng)基的pH值維持在7.8-8.5之間，然后在所述微藻的生長進入穩(wěn)定期時在所述培養(yǎng)基中再添加所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液，使所述培養(yǎng)基的pH值始終維持在9.0?10.0之間。
4.如權利要求1?3任意一種所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為30 μΜ-30πιΜ。
5.如權利要求4所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液是將N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸、去離子水和NaOH混合制成，所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液中所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的摩爾濃度為0.2Μ ?5Μ。
6.如權利要求1?3任意一項所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述微藻的培養(yǎng)條件為:8h?16h光照與8h?16h黑暗交替，溫度17°C?24°C，光照強度為50 μ mo I.m 2.s 1 ?200 μ mo I.m 2^s10
7.如權利要求1?3任意一項所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:在初始配制的培養(yǎng)基中，每IL所述培養(yǎng)基中包含如下組分:lmg?10mg NaNO3, Img?50mgNaH2PO4.2H20，Img ?50mg Na2EDTA, Img ?50mg FeCl3.6H2O, 0.01 μ g ?Img CuSO4.5H20，0.01 μ g ?Img ZnSO4.7Η20，0.01 μ g ?Img CoCl2.6H2O, 0.01 μ g ?Img MnCl2.4Η20，0.0001 μ g ?Img Na2MoO4.2Η20，0.0001 μ g ?Img 維生素 Β12，0.01 μ g ?1mg 維生素 BI和0.0001 μ g?Img維生素H。
8.如權利要求1?3任意一項所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述微藻為褐指藻屬。
9.如權利要求8所述的促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述微藻為三角褐指藻藻種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進微藻油脂積累的培養(yǎng)方法，將微藻接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在所述培養(yǎng)基中添加N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液，添加所述N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸的緩沖液后所述培養(yǎng)基的pH值始終維持在9.0～10.0之間。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以提高微藻油脂產量，同時又不影響微藻的生物量。
【IPC分類】C12P7-64, C12R1-89
【公開號】CN104789608
【申請?zhí)枴緾N201510219454
【發(fā)明人】張惠瑩, 陳道毅, 劉建
【申請人】清華大學深圳研究生院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月30日